摇瓶工艺—细胞传代和冻存

名字不重要

一. 准备工作
参见“摇瓶工艺—细胞复苏。

二. 操作流程：
2.1 细胞复苏
参见“摇瓶工艺—细胞复苏”。

2.2 传代扩增
从培养第2天开始取样计数，传代前细胞培养时间一般不超过4天。

用Vi-cells细胞计数仪检测活细胞密度和活率，判断细胞是否符合传代培养标准。若细胞符合传代标准，完成细胞传代操作。否则继续培养，且连续培养不超过4天。

根据工艺要求，将种子液全部传代（用这种方法，多一个参数“取样前/后理论培养体积”--忽略摇瓶挥发体积）或者部分传代，进行1~n次传代扩增；每次传代时，根据计算结果，确定所用摇瓶规格及摇瓶数量。传代完成后，根据计数结果判断是否符合传代扩培后标准。

注意1：根据细胞液理论体积用来计算总细胞数，以及用来计算传代后培养体积和预热培养基体积，以及可能添加MSX母液量的计算。

注意2：摇瓶挥发体积与摇瓶种类、培养基、摇床参数都有关系。

根据目标冻存支数（需要满足最小冻存支数要求），决定目标所需细胞数量，确定最终培养体积和密度。

根据预估传代次数和生长趋势，进行冻存前评估，若细胞符合冻存标准，完成细胞冻存操作。否则，继续培养并每天取样计数，直至符合标准后完成冻存操作，连续培养不超过4天。具体如下：

根据密度和理论培养体积计算理论总细胞数（各个摇瓶细胞数相加），按照10×106 cells/支（有时是15×106cells/支），1 mL/支规格冻存细胞，计算理论最大冻存细胞支数（最大冻存支数向下取整，如计算的理论最大冻存支数为200.9支，则向下取整，理论最大冻存支数为200支）。判断是否满足目标细胞冻存支数要求，若满足，则进行冻存操作。

注意：需要考虑到理论培养体积的挥发，实际培养体积会减少，理论最大冻存支数要有足够操作空间。

2.3 细胞冻存
合瓶：若冻存细胞由1个以上摇瓶培养，则需要将多个摇瓶细胞合并并混匀后取样，并重新计数。计算合并后理论冻存细胞支数（同上描述）。

注意：若预估细胞数足够，合瓶操作也可在冻存液配制完成后再进行。

根据细胞计数结果，确认是否将所有细胞液进行冻存，分为全部冻存和部分冻存，差别在于配制冻存液体积，然后计算。

全部冻存：按照10×106cells/支（有时是15×106 cells/支），1 mL/支规格冻存细胞，计算细胞冻存液体积（最小配制体积至少向上取任意整数，如5.1 mL，则至少配制6 mL，考虑损耗可多配制，使用时根据冻存支数用移液管量取）。所需细胞冻存液体积=活细胞密度×取样后理论培养体积÷（10×106），按照理论体积计算（实际有挥发），冻存液体积足够。

部分冻存：所需细胞液体积=计划冻存支数×冻存密度÷活细胞密度（体积向上取整）；按照计划冻存支数及1 mL/支规格冻存细胞，计算细胞冻存液体积（若为1 mL/支，所需细胞冻存液体积=计划冻存支数）。

配制冻存液：根据冻存细胞支数计划，计算所需细胞冻存液的体积，从而得出所需培养基和DMSO体积。培养基与 DMSO按体积比9：1添加配制细胞冻存液，混匀后，将配制完成的细胞冻存液置2-8℃冰箱预冷至少30 min。考虑损耗可多配制冻存液。

冻存管标签粘贴：在生物安全柜内提前将冻存标签贴于冻存管上，按照顺序粘贴并放置，防止冻存过程编号混淆。（标签要QA协助领用、使用和销毁多余标签）

细胞分装和离心：在生物安全柜内，缓慢摇匀合瓶中的细胞，用无菌移液管将所需细胞转至离心管中，分装过程中记录细胞悬液分装支数，规格及分装总体积。800 rpm，离心5 min，离心后将上清液在生物安全柜中转移至新离心管中（可能需要送检上清无菌和支原体）。如冻存部分细胞液，则将剩余细胞液废弃，并记录废弃数量。

由于部分冻存和全部冻存，需要确认最终实际分装体积（主要影响“全部冻存情况”，因取样及挥发，实际分装后培养体积少于理论培养体积属于正常情况，细胞实际冻存时以分装实际体积为准）。根据细胞悬液实际分装体积，确认冻存细胞支数。按照10×106 cells/支，1 mL/支规格冻存细胞，计算冻存细胞支数（最大冻存支数向下取整数，如理论冻存200.9支，实际冻存200支）。细胞冻存支数=活细胞密度×分装体积÷（10×106）。

重悬准备：取出预冷完成的细胞冻存液以及分装的离心管，清洁后转入生物安全柜，无菌擦拭。注意：离心管不可倾斜，保持向上放置。

细胞重悬：离心后用无菌移液管吸取并弃去上清液后（或者无菌倒掉），加入适量冻存液重悬细胞（注意：用于重悬的冻存液体积需要记录，最好固定一个恰当的数值，方便计算，后续合瓶后添加至目标体积）。最后根据需要，将所有离心管中的细胞悬液合并，最后加至目标冻存液体积并缓慢混匀，准备分装冻存。

细胞分装：将混匀状态下的细胞悬液全部分装至2 mL冻存管内，每管分装1 mL。注意：分装过程中，每完成一次移液管取样分装，下次取样分装前需混匀细胞并更换移液管。

细胞冻存：完成分装后，根据需要选择冻存方法。使用程控降温仪进行冻存，或者使用程序降温盒进行冻存。

程控降温仪：冻存管转入细胞冻存盒，放入程控降温仪，启动冻存程序，进行-80 ℃冻存降温。具体程序：腔体先降至4℃后，Ramp 1.0℃/min 降至样品温度为-4.0℃，Ramp25.0℃/min降至腔体温度为-40℃，Ramp 10.0℃/min降至腔体温度为-12.0℃，Ramp 1.0℃/min 降至腔体温度为-40℃，Ramp 10.0℃/min 降至腔体温度为-80℃，程序结束。完成该步骤后，将细胞转移到液氮容器中，长期存储。

程序降温盒：冻存管转入已经预冷完成（2~8℃）的程序降温盒，然后放入-80 ℃冰箱进行冻存。在-80 ℃冰箱进行冻存24 h后，转移至液氮容器。

冻存申请（入库）：填写细胞冻存申请单，确认细胞库台账登记准确。细胞转移至液氮容器24 h后，方可复苏冻存细胞进行冻存细胞评估。根据需要，另起批记录记录该操作过程。

操作环境监测：生物安全柜内操作结束时，完成表面微生物（五指和/或设备表面）、悬浮粒子（QC左右各取样一个）及浮游菌取样（QC左右各取样一个）。

此外，细胞冻存操作过程，监测沉降微生物。将培养皿分别放置在生物安全柜的左侧、中间和右侧，监测细胞冻存的整个过程。培养皿放置完成后，不可移动，直至冻存操作完成后，由放置人员收回培养皿。

请验内容：复苏开始和结束，冻存上清无菌和支原体，冻存开始和结束

细胞冻存后复苏评估：细胞建库完成后，取出3支细胞进行复苏，具体操作过程参见下期的细胞评估。

注：MSX的配置为50mM (粉末加水再过滤)，-20 ℃避光储存，有效期12个月。

注：培养基检测结果包含pH、渗透压、浊度、内毒、完整性等。

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胜利者

学习

逸清草堂

这内容怎么看起来那么熟悉

走吗

像我们这样的细胞，复苏没有用到摇瓶。

名字不重要

逸清草堂 发表于 2024-06-24 09:22
这内容怎么看起来那么熟悉

是吗？互相学习

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名字不重要

走吗 发表于 2024-06-24 10:32
像我们这样的细胞，复苏没有用到摇瓶。

贴壁细胞吗？工艺不一样的

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