取样及分析方法验证

画月秋雨

1 概述

验证类型：首次验证

验证方法：前验证

1.1  验证原因及目的

在对酮康唑乳膏接触设备在进行清洁验证中，采用的是棉签擦拭法取样，使用95%乙醇作为擦拭溶剂，HPLC法检测酮康唑残留含量。为了证明此方法能够有效将残留在设备表面的酮康唑活性成分擦拭下来，并且检测方法对残留浓度的酮康唑能够精确检出，故需进行擦拭取样回收率和检验方法的验证。以保证清洁验证的检测结果数据有效可靠。

1.2  验证范围

仅针对采用棉签擦拭法取样，使用95%乙醇作为擦拭溶剂，HPLC法检测酮康唑残留含量的接触酮康唑乳膏的设备内表面的取样和分析方法的验证；

1.3  参考文件

文件编号	文件名称	保管地点
	酮康唑乳膏质量规格标准及检验标准操作程序	档案室
	酮康唑乳膏工艺变更风险评估	档案室

1.4  验证小组

姓名		所在部门	职责
组长		验证部	协调验证工作的组织、监督及验证方案和报告的审批
组员		工艺技术部	验证方案和报告的审批，技术指导
		工艺技术部	验证的具体实施
		QA部	现场监控、取样
		QC部	验证方案和报告的审批
		验证部	编写验证方案和报告

1.5  先决条件

为保证验证的顺利进行，必须保证以下材料及设备已经准备好。

序号	名称	型号	备注
1	钢板	50×50cm	为316不锈钢，刻划好10cm*10cm的方格，清洗好，自然晾干备用
2	酮康唑原料	批号	已经过检验
3	酮康唑对照品	-----	中检所
4	高效液相色谱仪	-----	处于验证或效验有效期内
5	移液管	1ml	已校验，并清洗备用
6	棉签	药签	无灰
7	容量瓶	-----	已校验，并清洗备用

1.6 培训

验证方案批准后，验证执行前，对验证小组各成员进行培训，掌握本次验证的要领并学习验证各相关文件，确保验证工作正确执行。培训情况填写于附页《文件培训记录》。

2验证内容

清洁分析方法验证是指用于检验生产车间设备清洁后检查样品残留量的分析方法的验证。

依据《酮康唑乳膏工艺变更风险评估》里面计算的活性残留（酮康唑）限度为≤0.74μg/cm2，如果擦拭100 cm2的面积，最后定容至20ml，那么酮康唑残留的限度为≤3.7μg/ml（备注：还未乘以回收率，待确定了回收率后再代入计算）。对此方法的专属性、线性、准确度（取样回收率和检验方法回收率）、精密度、定量限、检测限、耐用性、稳定性等进行研究。

2.1分析方法及取样方法2.1.1分析方法

检测条件：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂，0.5%醋酸铵溶液-0.2%二异丙胺的甲醇溶液（23:77）为流动性，检测波长为240nm,进样量10ul，记录色谱图，按峰面积计算酮康唑含量，即得。

①  对照液的制备

取酮康唑对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并稀释制成0.1mg/ml的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

②  供试液的制备

将取过样的棉签头，迅速剪到盛有20ml95%乙醇，密塞，超声30分钟，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.2取样方法

    棉签擦拭法取样:

准备20ml的95%乙醇溶液于取样瓶中。设备清洗消毒后，将棉签在95%乙醇溶液中润湿。在取样位置的100cm2面积上用棉签擦拭，然后立刻剪入盛有95%乙醇溶液的广口瓶中，迅速盖上瓶塞，密闭。

棉签准备及棉签擦拭法示意图:

棉签应为脱脂棉事先进行脱灰处理，不掉落纤维。擦拭时，每个取样点使用1个棉签，用中等力度（签棒轻微弯曲）依据“棉签擦拭取样示意图”平稳而缓慢地在100 cm2范围内擦拭；翻转无菌棉签，使用棉签的另一面按照同样的方式进行擦拭。擦拭完毕后，将棉签立即剪入装有20ml的95%乙醇溶液中，迅速盖上瓶塞。

2.2分析方法的验证2.2.1专属性试验

为了证明在其他成分可能存在的条件下，采用的方法能正确测定出被测物的特性的能力，所以要进行专属性的试验。通常需要考虑单因素、多个因素同时存在时对测定的干扰。

1）对照品的制备：取酮康唑对照品适量，精密称定，加无水乙醇溶解并稀释制成每1ml约含酮康唑0.1mg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

2）空白溶剂：精密量取95%乙醇10µl注入液相色谱仪，记录色谱图，得空白溶剂色谱图。

3）棉签空白：取一空白棉签，蘸取95%乙醇湿润后，按取样擦拭方法擦拭空白不锈钢板100cm2，置于20ml95%乙醇中，超声30min，取此溶液10µl注入液相色谱仪，记录色谱图，得棉签空白色谱图。

比较以上三张色谱图，查看此方法是否具有专属性，溶剂、棉签及擦拭方法是否会带来干扰。

结论：                                                                     

                                                                              

2.2.2检测限和定量限

清洁验证是要确定痕量的残留物，检测限和定量限都是清洁验证非常关心的，如果计算出的活性残留限度的值低于检出限和定量限，那么就证明此分析方法不适用或残留限度或计算不合理等，需要重新考虑。

取上述（2.2.1中）所配制的标准溶液稀释成一系列的浓度，当S/N=10时，即为定量限；当S/N=2或3时，即为检测限。

记录检测限和定量限浓度，与酮康唑乳膏的活性残留限度相比较，活性残留限度必须高于检测限和定量限。

名称	定量限	检测限
S/N
浓度（µg/ml）

结论：                                                                     

                                                                             

2.2.3准确度和回收率

为了证明测定值与真实值之间的接近程度，需要考虑准确度，同时也要分析清洁取样和分析方法共同影响的回收率的高低。

1）对照品的制备：采用2.2.2中定量限的对照品浓度溶液作为对照品溶液。

2）供试品：采用已经经过检验的酮康唑原料分别用95%乙醇配制37.0μg/ml、74.0μg/ml、111.0μg/ml（浓度范围为被测物的残留限度的50%～150%）。以上浓度溶液分别精密量取1ml均匀涂在100cm2的不锈钢钢板上，（每个浓度分别涂制3块钢板，即9块），自然晾干。选取3个经过擦拭取样培训的人员，每个人用棉签蘸取95%乙醇后，按照要求分别擦拭9块钢板，擦拭完后分别剪入20ml95%乙醇中。密塞，超声30分钟，摇匀，即得供试品溶液。

以上溶液，分别进样10ul，记录图谱。要求：取样及检测的综合回收率≥50%，RSD＜20%。

回收率(%) =实际测得值÷理论测得值×100％

系列

实际标样值

μg

测得值

μg

回收率%

试验浓度1

1

2

3

试验浓度2

1

2

3

试验浓度3

1

2

3

平均回收率％（≥50%）

RSD%（＜20%）

结论：                                                                     

                                                                                

2.2.4精密度

系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差、标准偏差或相对偏差表示。

取供试品溶液（浓度为定量限）同法测定6次，结果RSD应不得大于2%。

序号	1	2	3	4	5	6
峰面积
RSD≤2%

结论：                                                                     

                                                                                

2.2.5线性和校正曲线

准备至少5个覆盖中间浓度的标准溶液（一般应该从定量限到残留物限度的200%，如果线性范围的下限即为残留物的限度，那么过程监控就失去了早期的报警的性能），相关系数不得小于0.99。

精密称取适量对照品，用95%乙醇制成6个不同浓度溶液（浓度应该包括定量限和残留物限度的200%），作为研究溶液，进行测定。并以浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标的线性关系曲线，得到的R2应＞0.98，并制作校正曲线。

线性范围

序号	浓度（μg/ml）	峰面积	标准曲线方程	R2
1
2
3
4
5
6

结论：                                                                     

                                                                                

2.2.6耐用性

为了确认方法的耐用性，使用同一批号的试验样品、对照品，使用不同的高效液相色谱仪、色谱柱，由不同试验人员进行操作，通过对比两次验证结果的偏差情况确认方法耐用性。

专照2.2.1、2.2.2、2.2.3、2.2.4、2.2.5的方法进行试验。

结论：                                                                     

                                                                                

2.2.7稳定性

将准确度测试中的某个浓度的样品，在室温下保持24、48小时后进样。溶液稳定性的接受标准为初始含量的98.0-102.0%。

名称	含量	偏差
标准样		----
24小时
48小时

结论：                                                                     

                                                                                

3 验证结果分析及评价要求

3.1验证报告中的每项数据分析、单项验证结论明确，内容详尽、合乎逻辑，能明确表达必要的验证步骤及项目、关键指标、操作过程和结果。运算及有效数字修约应符合规定；

3.2 在验证报告中说明分析方法、取样方法是否准确可靠；

3.3  在验证报告结论中，应给出每个验证结论的适用条件，指明那些条件的变更可能需要进行风险评估或再验证；

3.4  在验证完毕时，应说明分析方法是否有效可行，或者是否需要补充验证。

4 最终批准

如果本次验证符合GMP规范要求，验证结果符合可接受标准，各项结论明确，且参数和条件完整，建议报验证委员会审核批准。

如果验证结果不符合可接受标准，但验证过程符合GMP规范要求，建议报验证委员会审核批准验证报告，同时查找验证结果超标的原因，必要时修改验证方案，重新进行验证。

如果验证过程不符合GMP规范，或报告结论不明确，或适用条件不详，则不予批准验证报告。

云扬风轻

谢谢分享，学习了！

彩虹

学习了，谢谢。

wuguanghui953

学习学习。

dgtlyzh

谢谢分享，学习了！

画月秋雨

谢谢大家的支持

蓝剑

谢谢分享，学习了

宗徽

好贴，弱弱的问下，怎么没加风险评估呢

画月秋雨

宗徽 发表于 2013-10-25 16:58
好贴，弱弱的问下，怎么没加风险评估呢

这个东西不需要风险评估。

宗徽

画月秋雨 发表于 2013-10-28 10:04
这个东西不需要风险评估。

谢谢你的回复

画月秋雨

宗徽 发表于 2013-10-28 14:23
谢谢你的回复

不客气的。这个主要是参照药典附录来做的。

老普

画月秋雨 ，文件做的很好，有用。

画月秋雨

老普 发表于 2013-11-4 17:10
画月秋雨 ，文件做的很好，有用。

谢谢，希望对大家有用，同时也希望大家多提意见。

老普

谢谢了！有收获。

梅梅大胡

多多学习！脑袋都快木了！

松鹿

很有参考价值，谢谢！

草原梦想

学习一下，支持。

wubin8583

谢谢分享！！！

我要回家

谢谢，学习很多

xhf123456

支持，学习一下，谢谢。