【讨论】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与培养工艺开发

zhulikou431

【讨论】关于重组蛋白生产用的细胞株构建与培养工艺开发


有几个问题想请教一下。
1、一般情况下，反应器中的产量会比摇瓶中的产量提高多少？
2、在培养基优化过程中，一般会有怎样的指导原则？（我在优化培养基时，随意性很大没有明确目标）
3、关于大豆蛋白胨水解多肽在以后的工艺开发中会不会被淘汰掉（近10年）？
4、目前国内的抗体表达水平是多少？我们明年的任务是4G/L，不知道压力是不是很大。（今年是3g/l左右）
期待解答……

zhulikou431

1、关于乳酸的控制控制有哪些比较好的策略，根据以往的经验就是就是降低糖浓度，结果是有的时候管用有的时候不管用，对于下面的工艺开发就比较头疼了。
2、能否推荐一下关于反应器及工艺优化方面的介绍书籍，增加自己对这方面认识。


反应器产量有了过程参数的精确控制（pH/DO/temp），流加方案的优化，关键代谢指标的控制（糖、乳酸、谷氨酰胺、氨），应该有较大幅度的提高（30%），当然这个是case by case的，不能一概而论，更多的依赖于细胞株潜力和平台化的培养工艺开发效率。
2、培养基优化的常规方法与思路（参考《用于重组抗体生产的细胞大规模培养工艺开发》）
3、不仅大豆水解物，还有小麦水解物，酵母水解物，肯定是要淘汰的。这些添加物本身成分不明确，质量不可控。培养基的发展方向是CD，即化学成分明晰。
4、目前国内新上项目应该在2g/L左右。 如果不考虑具体的品种，市场容量对产能的要求。个人感觉4g/L没有必要。 重组抗体的产业化工艺开发不仅是细胞培养这一个环节。TITER过高对于下游的压力。对于产品质量的影响，都应该考虑。




1）控制乳酸，
首先应考虑葡糖糖的限制性流加策略，即根据细胞的葡萄糖消耗速率进行培养基流加。考虑到葡萄糖浓度控制过低（<1g/L）时，培养基中其他营养成分可能消耗殆尽，一般残糖的控制水平可以控制在2-5g/L左右。
目前商品化的培养基及流加策略，都有可供参考的protocal，可以直接在此基础上进行工艺优化。
文献中报道的乳酸阈值（影响细胞生长、抗体质量的乳酸浓度）58mM，l流加培养操作模式下，一般很少能达到。
其次，细胞培养工艺中pH的控制，对乳酸的生成也有影响。一般情况下，pH控制高，即偏碱的环境是刺激细胞产酸的。所以一般表达重组蛋白的培养工艺中，生产期的pH要控制的偏酸性。
最后，溶氧不足也会造成细胞无氧呼吸，代谢产酸的。
至于报道的使用半乳糖替代葡萄糖，不做推荐。
2） 细胞培养的参考书籍
推荐hu weishou 《Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies》google可以查到免费电子版本。

zhulikou431

另外询问一个问题，反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢，还是会伴随整个培养过程一直出现？

幻影

，是不是又开始论坛搬家了。

zhulikou431

zhulikou431 发表于 2014-5-16 13:45
另外询问一个问题，反应器中溶氧不足是培养过程中某个特定阶段的问题呢，还是会伴随整个培养过程一直出现？

以下是个人浅见，未必正确，仅供参考。
1、溶氧需求是个变化的过程
完整的细胞培养过程（无论batch、Fed Batch还是Prefusion）中溶氧的需求应该是一个变化的过程。
因为，从细胞接种后，发酵罐的细胞总数、代谢活力会逐渐增加。此时耗氧量会逐步上升。当进入蛋白表达期后，通常由于降温的作用，细胞进入稳定期不再增殖，耗氧量日趋平缓，甚至下降。
以上过程，如果使用三角瓶或简单的一次性反应器（如WAVE 20/50）批式培养，溶氧值的变化，会更为直观的体现出来：先下降后稳定，最后稍显升高。
2、DO的绝对值不重要、DO的变化才是关键
动物细胞对氧气的比消耗速率可以认为是个常数（当然也受代谢的影响），目前产业化流加培养的细胞密度1-2*10E7/ml，与微生物发酵的细胞密度相比（酵母、大肠等），存在数量级的差距。因此，一般情况下，溶氧的需求不是细胞大规模培养的限速步骤。对于灌注培养，虽然细胞密度相对较高（N*10E8/ml），溶氧需求也可以通过通入空气、氧气的混合气体来满足。
以上这些，只要在发酵罐上设定溶氧控制范围，保证氧气钢瓶有足够的分压，便可通过反应器期内部的PID程序实现DO的精确控制（一般60~80%）。
值得注意的，DO的剧烈波动会影响细胞的活性、产物的质量。前者是笔者有经验之谈。后者可见大量文献报道，DO对糖基化程度的影响。
3、回到初始问题，培养过程中溶氧不足。我觉得是否可以先从反应器上找原因

yuansoul

幻影 发表于 2014-5-16 13:45
，是不是又开始论坛搬家了。

搬家还是拆迁？

幻影

yuansoul 发表于 2014-5-16 14:07
搬家还是拆迁？

那边那么大的坛子，搬点就算了，哪能拆得了呢。

yuansoul

幻影 发表于 2014-5-16 14:08
那边那么大的坛子，搬点就算了，哪能拆得了呢。

那就是地震后捡碎砖头？

幻影

yuansoul 发表于 2014-5-16 14:11
那就是地震后捡碎砖头？

你那天说的倒是谁是谁的问题，答案是啥？

yuansoul

幻影 发表于 2014-5-16 14:13
你那天说的倒是谁是谁的问题，答案是啥？

就是这个人淫就是某丁香的二师弟，但是他是会36般变化的二师弟，且不承认师承关系。

幻影

yuansoul 发表于 2014-5-16 14:18
就是这个人淫就是某丁香的二师弟，但是他是会36般变化的二师弟，且不承认师承关系。

意思是同一个人？不能够吧。

yuansoul

幻影 发表于 2014-5-16 14:29
意思是同一个人？不能够吧。

那就是双胞胎

幻影

yuansoul 发表于 2014-5-16 16:04
那就是双胞胎

哈哈。反正我看不到ip，我不知道。

summerrain

lz又开始分裂了