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方法学的验证是为了证明当前采用的分析方法适用于相应的检测要求。在实际的操作过程中有时候会需要进行方法学的在验证，那么什么情况需要再验证呢？有几下几种情况： 1、生产工艺的变更，不管是原料药还是制剂工艺，只要变更了就需要方法学的再验证； 2、制剂的处方变更，使用的辅料与原来的不一样了，这时候需要进行方法学的再验证； 3、分析方法的修改，这个不用说了，方法都变了，那更需要方法学的再验证了。 方法学验证的内容：专属性、准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、线性、范围、检测限、定量限和耐用性。 一、专属性 专属性是指在其他成分如杂质、降解产物、辅料等存在的情况下，采用的分析方法能够 正确的检测目标物。一个方法不专属的时候可以用多个方法补充。各峰的分离度不得小于2.0，主峰的拖尾因子不得大于2.0，虽然分离度不小于1.5就可以定量，但是随着色谱柱的使用次数增加，柱效会下降，因此尽量要让分离度不小于2.0 1、鉴别 能够区分可能共存的或结构相似的化合物 2、含量测定和有关物质测定 （1）有杂质对照品情况下： 含量的测定可以在试样中加入一定量的杂质或辅料，并与未加杂质或辅料的试样进行对比，考察测定结果是否受到杂质或辅料的干扰。 杂质测定则可向试样中加入一定量的杂质，观察杂质之间，杂质与主成分之间是否能够有效分离。 （2）无杂质对照品情况狂下： 用高温、酸、碱、氧化、光照、紫外对试样进行降解，这可以研究将产物及样品的降解途径。可采用二极管阵列检测器，进行峰纯度的检查。有条件的可以使用液质检测。 二、准确度 1、含量测定方法的准确度 原料药： 用已知纯度的对照品或供试品测定，在规定的范围内，至少用9个测定结果进行评价，一般是设计3个不同浓度，每个浓度制备3份供试品溶液，分别测定其含量，将实测值与真实值比较，计算回收率。 制剂： 采用原料+辅料的测定方法，目的是考察制剂中辅料对含量测定方法的影响，在规定的范围内，至少用9个测定结果进行评价，一般是设计3个不同浓度，每个浓度制备3份供试品溶液，分别测定其含量，将实测值与真实值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 2、有关物质定量测定 向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定，在规定的范围内，至少用9个测定结果进行评价，一般是设计3个不同浓度，每个浓度制备3份供试品溶液，分别测定其含量，将实测值与真实值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。 三、精密度 精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用标准偏差或相对标准偏差表示。 精密度是考察分析方法在不同时间，不同人员操作，或在不同实验室所获得的结果的重复性或重现性。 1、重复性 在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。 在规定范围内，至少用6个测定结果进行评价。 可接受标准为： 含量：6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0% 有关物质：6份供试液含量的相对标准差应不大于15% 2、中间精密度 在同一个实验室，由于实验室内部条件的改变，如不同时间由不同分析人员用不同仪器测定所得结果之间的精密度，称为中间精密度。 可接受标准为： 含量：12个试液含量的相对标准差应不大于2.0% 有关物质：12个试液含量的相对标准差应不大于20% 3、重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。 四、线性 线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如含量测定，杂质定量检查均需要验证线性。 应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。 线性可接受标准： 含量：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 有关物质：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。 五、范围 1、原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80%－120% 2、制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70%－130% 3、溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的±20%，如规定了限度范围，则应为下限的-20%至上限的+20%; 4、杂质测定，范围应根据初步实测，拟订为规定限度的±20%。如果含量测定与杂质检查同时进行，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度(或上限)的+20%。 六、检测限与定量限 检测限（LOD）是指试样中被测物能被检出的最低浓度或量。检测限（LOD）是一种限度检验效能指标，反应方法是否有足够的灵敏度。 定量限（LQD）指试样中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果具有一定准确度和精密度。定量限（LQD）体现分析方法是否具有灵敏的定量检测能力。 常采用信噪比法，一般以信噪比为3：1或2：1时相应浓度或注人仪器的量确定检测限。一般以信噪比为10 ：1时相应浓度或注人仪器的量确定定量限。 定量限可接受标准： 含量：配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0% 有关物质：配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0% 七、耐用性 耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。典型的变动因素有:被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有:流动相的组成和pH值、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。气相色谱法变动因素有:不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、不同类型的担体、柱温、进样口和检测器温度等。 经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。 含量耐用性：分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。 可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。 有关物质耐用性：分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。 可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。 如果在设定的变化范围内，耐用性不好，可以适当的缩小变化范围直到拥有良好耐用性。
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发表于 2014-6-11 20:23:26
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