微生物验证，欢迎挑错

lch

这时我们的微生物方法适用性试验方案，请各位帮忙指出有何不妥

1. 验证方案制定依据

《中国药典》2015年版四部1105《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》、1106《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》。

2. 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验

   本试验所使用的培养基均必须为经计数培养基适用性检查合格的培养基。

   用3批不同批号的xxx样品分别按下述方法进行三次适用性试验。

2.1 试验菌液的制备和使用

试验菌株	试验菌液的制备	计数方法适用性试验
		需氧菌 总数计数	霉菌和酵母菌总数计数
金黄色葡萄球菌 [（CMCC（B）26 003]	接种菌株的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基上，培养温度30~35℃，培养18~24小时； 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量为不大于104cfu/ml的菌悬液。	胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30~35℃培养时间不超过3天，接种量不大于100cfu。
铜绿假单胞菌 [（CMCC（B）10 104]
枯草芽孢杆菌 [（CMCC（B）
白色念珠菌 [（CMCC（F）98 001]	接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基上，培养温度20~25℃，培养2~3天； 培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量为不大于104cfu/ml的菌悬液。	胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30~35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。	沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养温度20~25℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu。
黑曲霉 [（CMCC（F）98 003]	接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度20~25℃，培养5~7天；加入3~5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱；然后，用管口带有无菌薄棉花的无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量为不大于104cfu/ml的孢子悬液。

注意：菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用；

黑曲霉孢子悬液可以在4℃下保存4周，居于生物安全理由应尽量减少黑曲霉菌菌液制备次数和反复操作黑曲霉。

2.2 供试液制备

取同一批号的供试品10g，置无菌匀浆杯中，加入100mlpH无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，用HTY-761匀浆仪匀浆3min×6000r.min-1，作为1：10的供试液。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.3 接种和稀释

    2.1项表中所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一按下述方法进行试验。

（1）2.3.1 试验组  

取1：10的供试液9.9ml于试管中，加入0.1ml试验菌液（需氧菌总数计数用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，霉菌和酵母菌总数计数用白色念珠菌和黑曲霉），混匀，使每1ml供试液含菌量不大于100cfu。

（2）2.3.2 供试品对照组

取1：10的供试液9.9ml于试管中，加入0.1mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀。

（3）2.3.3 菌液对照组

取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml于试管中，加入0.1ml试验菌液（需氧菌总数计数用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，霉菌和酵母菌总数计数用白色念珠菌和黑曲霉），混匀。

2.4 供试品中微生物的回收

    平皿法 取5.3项各组制备的供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，立即倾注15ml~20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基（用于需氧菌总数计数）或沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基（用于霉菌和酵母菌总数计数），混匀，凝固，每种菌株或供试液每种培养基平行制备2个平皿。倒置培养基，按5.1项“总数计数”项规定条件培养、计数。

2.5 结果判断

   计数方法适用性试验中，试验组菌落数减去供式品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5~2范围内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

   否则，应变更微生物回收方法，如采用薄膜过滤法或MPN法，并重新进行计数方法适用性检查。

   方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。

3. 控制菌（大肠埃希菌）检查方法试用性试验

本试验所使用的培养基均必须为经培养基适用性检查合格的培养基。

   用3批不同批号的卡培他滨肠溶片样品分别按下述方法进行三次适用性试验。

3.1 试验菌株

大肠埃希菌[（CMCC（B）

金黄色葡萄球菌[（CMCC（B）

3.2 试验菌液制备

接种大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基上，30~35℃培养18~24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含菌数不大于100cfu的菌悬液。

注意：菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2~8℃可在24小时内使用。

3.3 供试液的制备和增菌培养

3.3.1供试液的制备同需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验。

3.3.2取5.2项下制备的1：10供试液10ml至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入不大于100cfu的大肠埃希菌菌悬液作为试验组；另取供试液10ml至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液作为阴性菌对照组。置30~35℃培养18小时。

3.4 选择和分离培养

取3.3.2项培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42~44℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30~35℃培养18小时。

按此检查方法在规定的温度和最短的时间下培养，应能检出所加试验菌的反应特征。即阳性菌对照组麦康凯液体培养基呈显色反应，在麦康凯琼脂中所长菌落特征为：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。而阴性菌对照组没有此反应特征。若检出大肠埃希菌的反应特征，判检出大肠埃希菌；若未检出大肠埃希菌的反应特征，判未检出大肠埃希菌。

3.5 结果判断

    若检出大肠埃希菌，可按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的控制菌检查；若未检出大肠埃希菌，应重新建立大肠埃希菌检查方法（消除供试品的抑菌活性），并重新进行方法适用性试验。

4. 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，微生物限度检查法应重新进行适用性试验。

本人新手一枚，有何不对之处望各位不吝赐教，小的不胜感激

笨笨熊1225

比我做的好

静水蓝心

学习了。

wopan2012

学习了..。

火舞精灵

需氧菌检测时 白色念珠菌和黑曲霉 培养3天就可以了 虽然菌落形态不是很完美 但对于计数及回收率却是足够了  黑曲霉在培养过程中不宜挪动 时间长了 可能不宜计数

harryliu00799

感觉你照抄药典啊，还参杂了一点10版药典的内容

A水杉

不建议用MPN

lch

A水杉 发表于 2016-10-29 07:57
不建议用MPN

没有用到MPN法，这里用的是平皿法

lch

harryliu00799 发表于 2016-10-28 18:09
感觉你照抄药典啊，还参杂了一点10版药典的内容

具体是哪里参杂了10版的，望回复

lch

火舞精灵 发表于 2016-10-28 17:23
需氧菌检测时 白色念珠菌和黑曲霉 培养3天就可以了 虽然菌落形态不是很完美 但对于计数及回收率却是足够了  ...

好的，谢谢提醒

兜兜

回收做几组？

lch

兜兜 发表于 2018-1-16 17:14
回收做几组？

每个菌每种浓度做两组

海深1

是不是涉及的所有产品都要单独做微生物计数方法验证，我的理解是不需要，这只是计数方法的验证，所有的产品都是用这一个计数方法。是不是不用每个品种都做吧，请大家回复一下。

小金库

谢谢分享。