渐入佳境，我触及创新药研发的动物实验

蒲公英

作者：阿郎  来自：蒲公英（ouryao.com）

2003年9月我国《非临床研究质量管理规范》才正式颁布，创新药的药理毒理研究是需要在通过非临床研究质量管理规范认证（简称GLP认证）的实验室才能开展动物的药理毒理实验，最新版的GLP规范是2017年9月1日起实施，总共有12章50条，内容主要包括术语及其定义，组织机构和人员，设施，仪器设备和实验材料，实验系统，标准操作规程，研究工作的实施，质量保证，资料档案，委托方等。

GLP是源自美国1978年12月22日发布的良好实验室试验质量管理规范，要求凡是新药动物试验如果不符合GLP标准是不予受理及批准的。GLP用于规范与人类健康和环境有关的非临床安全性评价的一套组织管理体系，指有关非临床安全性评价研究机构运行管理和非临床安全性评价研究项目试验方案设计、组织实施、执行、检查、记录、存档和报告等全过程的质量管理要求，旨在确保实验结果和记录的真实性、完整性和可靠性。GLP试验范围包括：单次给药毒性试验（啮齿类、非啮齿类），多次给药毒性试验（啮齿类、非啮齿类），生殖毒性试验，遗传毒性试验（Ames、微核试验、染色体畸变），致癌试验，局部毒性试验，免疫原性试验，安全性药理试验，毒代动力学试验，依赖性试验共10项。根据《国务院对确需保留的行政审批项目设定行政许可的决定》（国务院令第412号）附件第353项“药物非临床研究质量管理规范（GLP）认证”中明确GLP认证实施机关是国家食品药品监管局，通过GLP认证检查的国家局会核发GLP认证批件。

因为GLP批件有效期是3年，国家对认证实施动态管理，GLP认证标准严格，资质市场资源稀缺，截至2021年底，国家局在3年内批准有31家，最高峰时市场有60多家机构通过认证，而2014年以来申请机构呈下降趋势，2020年仅认证7家。GLP认证是目前国家局对GXP（质量体系）中唯一还保留的一项质量认证体系证书，可见符合GLP具有其不可捍动的重要地位。

2002年我参与的一个一类生物创新药，是从我国特有的某蜘蛛毒液中提取的一种氨基酸短肽化合物，为N-型钙离子通道阻滞剂，用于治疗各种急、慢性疼痛，尤其是对吗啡类控制无效的晚期癌症的疼痛病人。该药的药效、药理毒理是在湖南某大学动物房进行的动物实验，实验条件已比我之前自建的动物房好几倍，做动物实验基本是硕士、博士的正规军团队，虽然该动物房只是通过了省级使用许可检查，还达不到国家GLP认证条件。在开展动物药效的生物学评价时，该药镇痛效应主要表现为对神经肌肉接头处神经信号传递的阻滞，故可用小白鼠膈神经一膈肌试验或输精管试验来检测。膈神经一膈肌做法是，剥制小白鼠体重20－25克的膈神经一膈肌标本，用持续O2和CO2的混合气体保持标本活性，然后通过吸附电极向标本膈神经施加电刺激，膈肌会收缩转化为电信号，再由二道生理议记录下来，最后通过抑制膈肌收缩的时间来确定该药的生物学活性的大小；输精管试验和上面原理、操作相类似，不同是使用体重28-32克雄性小白鼠的输精管。该药动物药效方面，还做了福尔马林致炎模型镇痛、硬膜外腔用药在蜜蜂毒致炎疼痛模型镇痛、急性内脏疼痛模型镇痛；在安全性方面，一般药理学做了清醒和麻醉状态下的大鼠和比革犬，急性毒性实验做了大鼠、恒河猴，长期毒性试验做了大鼠连续8周恢复2周和12周给药，比革犬连续3个月给药及恢复2周，还有猕猴和大鼠的药代动力学、分布、代谢及排泄，致突变进行了Ames试验、染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验，生殖毒性做了大鼠致畸敏感期毒性试验和小鼠围产期毒性试验，过敏性做了皮肤过敏和全身过敏试验，还做了溶血性和血管刺激性试验，药物依赖性做了小鼠催促戒断试验、大鼠催促戒断试验和大鼠条件性位置偏爱试验。通过药效毒理动物试验证明，该药作用机理明确、镇痛效果强、无瘾性，是目前国际、国内吗啡类药物控制无效的替代药物。动物试验证明已接近或达到死亡剂量，但仍没有出现阿片样戒断反应及欣快效应，因此也间接证明该药不具有产生依赖性的潜力。

另外我参与最多的一个获得上市批文的一类新生物制品，和动物相关的有三个方面，一是该药本身就从小鼠颌下腺组织提取纯化而来，二是生物活性检测使用鸡胚背根神经节，或是PC12细胞和TF1细胞，三是药效和毒理是委托军科院的GLP中心规范进行的动物实验。

首先，原材料小鼠是由拥有国家正式批准的实验动物生产许可证的供应商生产的，一批产品的投料需要几万只小鼠，没有一定的养殖规模是无法满足生产需要，小鼠得在SPF条件的洁净区内饲养，体重符合条件后得在洁净室内按规范操作SOP采摘颌下腺，冷冻保存再运输到生产企业，最关键是固定和稳定经基因克隆表达率高的鼠种，还有雌雄区别，如果不只一家供应商，特别经过证明南、北方提供同一鼠种其颌下腺能提取到该药物的收率差了好几倍。

其次，在生物活性检测方面，法定方法还是鸡胚背根神经节法，是从一定日龄的未孵化的鸡蛋中在显微镜下挑取生长旺盛的鸡胚背根神经节进行培养，加入该药物，经过几天培养药物会促进神经节旺盛生长，在显微镜下计算生长神经状况进行半定量计算效价；原理是鸡胚背根神经节神经元表达有较多的该药受体，药物可诱导神经元长出纤维突起，因此，该方法能够满足物学活性测定的需要。采用PC12细胞和TF1细胞测定药物生物活性，主要是根据待测物质与细胞分化引起增殖的量效关系，是一种肉眼观察细胞生长状况为判断标准的测定法，但细胞的培养和测定影响因素也较大，从而影响效价测定的准确性。

最后，因该创新药是在军科院北京安评中心开展的药效毒理实验，该中心基本是我国最早GLP认证、资质实力最雄厚的机构，药效学包括损毁成年鼠交感神经末梢损伤模型、摄压法造成家兔尺神经机械性损伤模型、大鼠背根神经节体外培养法模型证明该药的有效性，一般药理学包括催眠小鼠和大鼠以及麻醉猫的实验，毒理学包括急性毒性、长期毒性、溶血性和刺激性、致突变、生殖毒性（三期）、家兔眼局部毒性。而在药代动力学研究包括放射性碘标记法小鼠和比革犬，小鼠几个剂量组是剂量相关、药效成正比关系，可在大动物比革犬上呈现不同的结果，高剂量组先本品血液浓度分布高、随时间推移反而标示的外源性本品浓度呈下降趋势，推断可能和比革犬大动物自体也会分泌产生该物质而抑制消除外源性本品有关，量效呈倒挂关系，预示动物种类不同反应的疗效和毒性也是不尽相同的。

这是我与实验动物的初次接触后，渐入佳境，开始触及创新药研发的动物实验，这是我与实验室动物不得不说的故事。

上一篇：「养老鼠，是我在制药圈的第一份职业」

未完待续：

桥导

您好，先问下，动物实验中，动物造成的个体差异极大，导致数据可能不稳定，那么请问这之中数据筛选应怎样做呢？

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蒲公英

桥导 发表于 2022-4-6 13:06
您好，先问下，动物实验中，动物造成的个体差异极大，导致数据可能不稳定，那么请问这之中数据筛选应怎样做 ...

按中国药典进行异常值检验，确定是否应该被剔除。（药典四部通则1431第209页有详细的计算方法）

得判断检验异常是否属于离群值，是离群值就剔除。药典有详细检验方法，一个是狄克森检验法，适用组内反应值个数较少的情况（一般小于13），还有一个格拉布斯检验法，都可以参照执行。

桥导

蒲公英 发表于 2022-04-06 21:41
按中国药典进行异常值检验，确定是否应该被剔除。（药典四部通则1431第209页有详细的计算方法）

得判断检验异常是否属于离群值，是离群值就剔除。药典有详细检验方法，一个是狄克森检验法，适用组内反应值个数较少的情况（一般小于13），还有一个格拉布斯检验法，都可以参照执行。

好的，收到，谢谢！

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