CAR-T 细胞疗法

朱家法1

CAR-T  细胞疗法，喆izi网络

朱家法1

CAR-T  细胞疗法
同义词 car-t细胞疗法一般指CAR-T
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CAR-T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。
T细胞也叫T淋巴细胞，是人体白细胞的一种，来源于骨髓造血干细胞，在胸腺中成熟，然后移居到人体血液、淋巴和周围组织器官，发挥免疫功能。其作用相当于人体内的“战士”，能够抵御和消灭“敌人”如感染、肿瘤、外来异物等。
在实验室，技术人员通过基因工程技术，将T细胞激活，并装上定位导航装置CAR（肿瘤嵌合抗原受体），将T细胞这个普通“战士”改造成“超级战士”，即CAR-T细胞，他利用其“定位导航装置”CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
中文名
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法
外文名
Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy
科普中国
致力于权威的科学传播
本词条认证专家为

潘静






目录
.1 治疗范围
.2 治疗流程
.3 不良反应
.4 如何应对不良反应
.5 影响CAR-T疗法的因素
.6 研究成果
基本信息
中文名  嵌合抗原受体T细胞免疫疗法
外文名 Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy
治疗范围
目前大部分CAR-T疗法还处于临床实验阶段，其中治疗范围集中在以下领域：
1.复发的急性B系淋巴细胞白血病（经过治疗缓解后再次发作），或者难治的急性B系淋巴细胞白血病（使用其他抗白血病治疗后病情没有缓解的）。
2.两种或两种以上方法治疗失败的大B细胞非霍奇金淋巴瘤。
3.CD19阳性复发、难治恶性淋巴瘤。
4.CD19治疗失败，CD22阳性的急性淋巴细胞白血病。
CAR-T疗法在其他抗肿瘤领域也有临床实验研究，但效果尚不明确。
治疗流程
标准的CAR-T治疗流程主要分为以下七个步骤进行：
1.评估病人是否符合CAR-T治疗的适应症
2.分离T细胞：通过外周血血细胞分离机从肿瘤病人血液中分离出单个核细胞，进一步磁珠纯化T细胞。
3.改造T细胞：用基因工程技术，把一个含有能识别肿瘤细胞且激活T细胞的嵌合抗原受体的病毒载体转入T细胞，即把T细胞改造成CAR-T细胞。
4.扩增CAR-T细胞：在体外培养以大量扩增CAR-T细胞。一般一个病人需要几千万，乃至几亿个CAR-T细胞，体重越大，需要细胞越多。
5.CAR-T细胞回输入人体：把扩增好的CAR-T细胞通过静脉回输到病人体内，开始进行肿瘤细胞免疫治疗。
6.监控反应：严密监护病人身体反应，尤其是细胞输入体内后一至两周内可能发生剧烈不良反应。
7.评估治疗效果：多在回输CAR-T细胞后第15天和第30天评估对原发病的治疗效果。
整个疗程持续5周左右，其中上述第一步到第三步需要2周，花费时间较长。

不良反应
CAR-T疗法无疑为癌症治疗带来新希望，然而，这种疗法也有严重不良反应，主要是细胞因子释放综合征（也叫细胞因子释放风暴，CRS）和神经毒性。如果处理不及时可能会危及生命。所以输注CAR-T细胞后必须严密监测。
细胞因子释放综合征（CRS）发生原因是由于大量CAR-T细胞输入体内，导致免疫系统被激活，释放大量炎性细胞因子，从而使人体产生严重不良反应。该综合征的临床表现包括：高烧，发冷，恶心，疲劳，肌肉疼痛，毛细血管渗漏，全身水肿，潮红，低血压，少尿，心动过速，心功能不全，呼吸困难，呼吸衰竭，肝功能衰竭，肾功能损害等。
神经毒性发生原因目前不是很清楚，可能与CRS有关。临床表现包括头痛，谵妄，语言的部分能力丧失，反应迟钝，癫痫发作，昏迷等，甚至因脑水肿引起死亡。
过敏反应也是可以预见的不良反应。主要是皮疹，其他反应无法跟CRS区分，对于呼吸困难，水肿，血压下降等症状临床会归于CRS反应。
如何应对不良反应
无论国内还是国外，CAR-T疗法安全问题一直是大家关注的焦点。目前来看，CAR-T疗法发生不良反应是不可避免的，CAR-T疗法还没有完全精准到只针对肿瘤细胞，而对正常人体细胞不起效应。
CAR-T细胞回输病人体内后需要病情监测15天到4周。头15天需要住院严密监测不良反应。出院后4周内不能离医院太远，以方便到医院及时处理不良反应。
通过这几年的努力，目前治疗机构已经形成了一套对付CAR-T疗法的不良反应的方案，包括治疗细胞因子释放综合征的有效药物：降低血液中IL-6水平的抗IL-6受体抗体-托珠单抗，同时激素的使用可以很好地控制其不良反应（NCCN2018年immunotherapy治疗指南）
通过提高临床预见性，识别不良反应的高危因素，可以降低不良反应发生的概率。例如：通过在CAR-T细胞回输病人体内前在预化疗中加入降低肿瘤负荷的化疗方案，以降低病人体内肿瘤负荷，达到减轻治疗不良反应。
CAR-T细胞治疗过程中全血细胞减少非常常见，对于本身存在感染的患者，治疗过程中，极有可能加重感染，若病人感染未得到控制，暂时不宜回输CAR-T细胞，应该待感染有效控制后再用。同时对于治疗过程中出现全血细胞减少的病人，必要的抗生素治疗可以有效阻止感染的发生。对于CAR-T治疗后长期随访的病人，B细胞及免疫球蛋白数量的减少也非常常见，建议每月一次的免疫球蛋白检测及丙球的输注，可以有效避免因低球蛋白血症导致的凶险感染。
影响CAR-T疗法的因素
1.病人的自身情况：CAR-T疗法的首要条件是能够从病人身上收集足够的高质量的T细胞。某些病人，由于前期化疗，或者疾病很严重，体内T细胞数量和质量都无法满足CAR-T疗法所需要的T细胞。另外，脑内肿瘤负荷大的病人，考虑到致命的不良反应，也是不能马上用CAR-T疗法。
2.CAR-T的制造工艺和过程：CAR-T疗法过程很复杂和高端。涉及T细胞的筛选收集、基因改造、活化、培养、扩增、修饰等，每一步都需要精心的设计和质量控制，哪一步出现差错都会影响CAR-T疗法。比如，有案例显示，T细胞中混入了B细胞杂质，导致病人对CAR-T疗法产生抗性。这说明细胞的纯度非常重要。
3.肿瘤自身的特性：有研究显示，接受抗CD19和抗CD22的CAR-T细胞疗法后一年内有近一半的病人肿瘤复发。这和肿瘤逃逸和CART持续性有很大关系。如何找到更多的肿瘤靶点并尽可能杀尽肿瘤，如何增加CART在体内的持续性还是有待改进和开发。
4.治疗的不良反应：一般来说，有细胞因子释放风暴的不良反应，表明机体对治疗有反应，杀灭肿瘤有效果。但是严重不良反应往往需要提前采取措施中断CAR-T细胞在体内的杀灭作用。这是否会影响消灭肿瘤的最终效果，还有待进一步评估。
体内肿瘤负荷：最近纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心（MSKCC）的研究显示，CAR-T细胞治疗前体内肿瘤负荷较轻（异常增生的原始细胞<5%）的患者，他们的治疗效果更好，长期缓解率更高。
另外，上述实验也显示，CAR-T细胞治疗后完全缓解率与病人是否进行过骨髓移植、化疗种类、患者年龄、做过几种治疗以及CAR-T的剂量等因素基本上都没有关系。
研究成果
2022年5月，《自然—医学》在线刊发北京大学肿瘤医院副院长沈琳教授团队最新成果。该研究第一期临床试验结果表明，靶向Claudin18.2（CLDN18.2）的CAR-T细胞疗法对消化道实体肿瘤治疗表现出良好的疗效。所有病例患者的客观缓解率和疾病控制率分别为48.6%和73.0%，超过目前CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗中的最好结果（30%以下）。

活的药物——CAR-T 疗法上市将带来什么？
今年8月，诺华制药“活的药物”CAR-T细胞疗法CTL-019获美国FDA批准，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病，在全球范围内吸引了包括学者、医生、患者、投资人的大量关注，被认为是肿瘤治疗史的一个“里程碑式”的事件。
今年8月，诺华制药“活的药物”CAR-T细胞疗法CTL-019获美国FDA批准，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病（ALL），在全球范围内吸引了包括学者、医生、患者、投资人的大量关注，被认为是肿瘤治疗史的一个“里程碑式”的事件。
从“Emily历险记”到“CAR-T疗法”元年
第一位吃CAR-T疗法“螃蟹”的是一位叫Emily Whitehead的小女孩。这个小姑娘5岁时被诊断患上急性淋巴细胞白血病，一般说来85%的ALL患者可通过常规化疗治愈，而Emily却没有那么幸运。她在接受第一轮化疗时便引起感染，双腿几乎不保。后来疾病复发，经治疗后再次缓解，Emily计划骨髓移植。然而Emily等待骨髓移植期间白血病又一次复发，这次再也无计可施了。
Emily接受了一种疯狂的、之前从未用于儿童身上的试验性疗法：抽取Emily的血液提取白细胞，用改良的艾滋病毒进行遗传改造，教会它们识别肿瘤细胞并进行杀伤，然后重新注入Emily体内。经历了噩梦般的连续高烧后，Emily在7岁生日那天挣脱了死神的束缚苏醒了过来。一周后骨髓检查正常，她的癌细胞不见了，医生和科学家们的疯狂试验成功了。

现在，Emily不仅是一个活泼可爱的12岁小女孩，而且她的“历险记”激励了一系列几近失败的CAR-T疗法研究。与Emily同样接受CAR-T治疗的都不是普通的病人，他们经历过包括化疗、靶向治疗，甚至骨髓移植等各种可能的治疗后，被医生判定生存时间不可能超过半年。诺华的Ⅱ期临床研究显示，63例患者接受CAR-T治疗后，3个月内83%的患者体内癌细胞完全消除，6个月生存率89％，治疗一年后仍有79％的患者存活。
2017年7月2日美国FDA肿瘤药物专家咨询委员会（ODAC）的专家们以10：0的投票结果一致推荐批准诺华CAR-T疗法。8月30日，FDA官方宣布批准诺华CAR-T细胞疗法CTL-019正式上市，商品名为Kymriah，定价为47.5万美金。FDA专员Scott Gottlieb博士说：“我们正在进入一个新的医疗创新前沿，能够重编病人自己的细胞来攻击致命的癌症，基因和细胞疗法等新技术能够在转化医学和治疗许多难治性疾病方面创造拐点。”
在此前两天，制药巨头Gilead科学公司宣布以119亿美元拿下了CAR-T研发领军人物之一的Kite制药，Kite的CAR-T疗法KTE-C19正处于FDA审评阶段。传统药企与新兴技术的结合充满想象，CAR-T疗法被聚焦在世界舞台的中央，2017年注定成为CAR-T元年，掀起全球性投资细胞免疫疗法的浪潮。

CAR-T是否为征服癌症的终极疗法？
CAR-T疗法的面世让看似无药可治的患者迎来新的曙光，CAR-T会是征服癌症的终极疗法吗？
一般说来，癌症患者体内都存在一定数量的免疫细胞，但这些免疫细胞之所以无力对抗癌症，主要原因：一是数量不足，二是不识别癌细胞。癌症被称作“永不愈合的伤口”，持续的炎症一直在消耗肿瘤患者免疫系统资源，导致免疫细胞兵力不足，长期疲于奔命，无力对抗疯狂增殖的癌细胞；另一方面，癌细胞通常会伪装成人体发育早期的干细胞模样避开免疫系统的监视，即便被识别还会及时按下免疫细胞的“自毁按钮”成功躲过攻击。
所谓CAR-T细胞，全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，就是从患者体内分离出免疫T细胞，用遗传修饰的方法进行改造，使其表达一种嵌合抗原受体（CAR），该受体能够在识别肿瘤细胞表面抗原的同时激活T细胞增殖和杀伤能力。这种CAR-T细胞要在实验室中大量培养，之后输回病人体内用于治疗。
CAR-T细胞像装备了“GPS定位”并关闭了“自毁按钮”的“生物巡航导弹”对癌细胞实施“饱和打击”，细胞被回输病人体内后会继续增殖，精准锁定癌细胞并将其歼灭。从理论上来讲，CAR-T细胞作为“活的药物”，会针对性地识别癌细胞，避免了对正常细胞的损害；有机会在人体内长期待命，抑制癌细胞的进化；CAR-T还可以成为一个平台技术适用于各种肿瘤。
实际上，CAR-T 这一概念早在1993年就被以色列科学家Zelig Eshhar提出，经过20余年研究改进，最近几年在临床上取得突破，但目前它的成功还局限于少数血液系统癌症，没有证据对实体肿瘤有效。全球数家公司的CAR-T疗法已经在白血病患者中产生令人印象深刻的缓解率，但较高的复发率影响了CAR-T长远发展的潜力。
但是，CAR-T疗法有细胞因子风暴、神经毒性、脱靶效应等严重的副作用，JUNO公司的CAR-T细胞JCAR015治疗造成多名患者出现脑水肿和因神经毒性死亡，从而停止了开发。而Cellectis公司的通用型CAR-T细胞UCART123临床试验治疗的首例受试者就因脱靶效应死亡，被FDA叫停。
诺华已上市的CAR-T细胞Kymriah具有可接受的安全性，但针对的是难治或者复发的白血病，也就是说，遇到其它疗法都不行的患者才会推荐用CAR-T。试验显示，CAR-T能够穿过血脑屏障，引发免疫响应，那么CAR-T很可能因为相同的机制穿越胎盘屏障，生殖毒性问题必须得到关注。
毫无疑问，CAR-T是近年来肿瘤临床上的巨大突破，给大家提供了无限的想象力，但他只是肿瘤免疫疗法的开端而非结局，任重而道远。




CAR-T与TCR-T的区别在哪里？
作者&#160;&#160;内容来源于互联网|发布：2016-11-24 11:54:25&#160;&#160;&#160;&#160;更新：2016-12-29 17:55:42
包括LAK，DC，CIK，DC-CIK，CAR-T，TCR-T，NK，CAR-NK，肿瘤浸润性淋巴细胞等等。但是经过十数年的研究，大浪淘沙始到金，眼下有出色作用的是CAR-T，TCR-T这两种细胞治疗方法。而NK，CAR-NK，TIL等技术还有待成熟，有待进一步完善。
肿瘤免疫治疗，实际上分为两大类。一种把肿瘤的特征“告诉”免疫细胞，让它们去定位，并造成杀伤；另一种是解除肿瘤对免疫的耐受/屏蔽作用，让免疫细胞重新认识肿瘤细胞，对肿瘤产生攻击(一般来说，肿瘤细胞会巧妙伪装，逃脱免疫的监视)。

第一种情况，因为要利用机体自身的免疫细胞，因此，目前多为免疫细胞治疗；后一种主要是阻断被屏蔽的免疫信号，因此，多为小分子药物和抗体药物，如大家熟知的PD-1/PD-L1一类，当然，还有其它类别，甚至联合应用效果更好。而在第一种情况（免疫细胞治疗）中，一直是研究的热点。包括LAK，DC，CIK，DC-CIK，CAR-T，TCR-T，NK，CAR-NK，肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）等等。但是经过十数年的研究，大浪淘沙始到金，眼下有出色作用的是CAR-T，TCR-T这两种细胞治疗方法。而LAK，DC，CIK，DC-CIK基本被证明是无效的，或基本无效，虽然仍然有一些学者在艰苦研究DC相关的治疗策略。而NK，CAR-NK，TIL等技术还有待成熟，有待进一步完善。

目前有三种使用效应T细胞的过继细胞疗法(Adoptive cellular therap,ACT)正朝着注册审批的方向行进（图1）。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）虽发展缓慢，但数十年来一直进步，近期一项针对转移性黑色素瘤的国际III期随机试验已经完成（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00200577），这项研究前后经历十多年，最终结果还是不错的，不管在复发还是长期生存方面，TILs都是有效的。
那么，什么是CAR-T和TCR-T呢？CAR-T（Chimeric Antibody Receptor Engineered T Cell）和基因修改的T细胞受体（Gene Modified TCR）。事实上，基因修改的T细胞受体技术的研发也已经有相当长的历史。这两种技术的一个共同点在于通过基因改造的手段提高T细胞受体对特异性癌症细胞抗原的识别能力和进攻能力。因此也都统称为“T细胞受体重新定向”技术（Tcell receptor redirection）。但两者所使用的方法是不同的。嵌合抗原受体T细胞技术（CART）以及T细胞受体（TCR）嵌合型T细胞（TCR-T）作为当前过继性细胞回输治疗ACT技术两大最新的免疫细胞技术，因其能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究，从最开始的基础免疫研究转变为临床应用。基于合成生物学，免疫学，遗传改造技术，使得合成改造的特异性功能加强版的T细胞成为可能。CD19抗原特异性CAR-T 细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤临床试验中，显示出持续的疾病缓解效果。由于CAR-T/TCR-T技术的优越表现，以及广阔的应用前景，从而使其进入了当前激烈的制药行业竞技舞台中与传统的制药业一较高低。

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图1：目前细胞治疗的几种途径。通过修饰，使正常供体细胞的同种异体排异反应失活，同时使用抗肿瘤的CAR或TCR武装它；或利用抗肿瘤分子武装患者自体细胞。在实体肿瘤中，活检标本可用来分离TILs并进行扩增。大多数情况下，病人在接受抗肿瘤淋巴细胞输注前需要接受必要的预处理，并须谨慎处置治疗引发的毒性。T细胞和T细胞受体T细胞是我们肌体细胞免疫机制中非常重要的一类细胞。这类细胞之所以被称为T细胞是因为它们成熟和分化的过程是在胸腺（Thymus）里完成的。T细胞有一点像我们身体的“纪委巡视组”。它们在肌体内巡逻时，不断地和各种细胞进行“亲密”接触，以检查细胞内部是否正常。而这种接触和检查工作主要是通过一种称之为“T细胞受体”来进行的。细胞方面和“T细胞受体”交接的是一类被称为“MHC”（或者在人类被称为HLA）的表面蛋白。这类蛋白的功能就是把细胞内部蛋白分解后的片段呈现给T细胞。供T细胞检查。如果T-细胞发现其中有变异的蛋白片段，就可能对细胞发起进攻，摧毁变异的细胞。这也就是我们免疫系统如何能够长期保持我们无癌生活的主要原因。但癌症还是会经常会发生。这里的原因固然很多，也很复杂。但总体来讲，癌症发生说明我们的T细胞已经失去了识别癌细胞以及摧毁癌细胞的能力。而提高T细胞的识别能力的关键就在于改进“T细胞受体”。从这个角度去思考，就产生了我们刚刚提到的这两种细胞免疫治疗技术：CAR-T和基因修改的T细胞受体。CAR-T与TCR-T的区别我们可以打一个简单的比喻。CAR-T是一种“换头”技术。它把TCR的“头”直接换成一个特异性的抗体。这样就可以让T细胞就在抗体的指引下直接进攻癌细胞。和CART这种大手笔的改动相比，基因修改的T细胞受体可以说只是简单地“理了理发”。用来“理发”的T-细胞并非任何T细胞。这类T细胞通常会“侵入”癌组织。这说明他们对癌细胞有一定的识别能力。事实上，我们可以在这类T细胞中发现对癌细胞相关抗原（Tumor Associated Antigen, TAA）具有特异性识别能力的T细胞。这类抗原包括CEA，Her-2，CD19，gp100, MART-1, MAGA-A3, NY-ESO-1, 等等。这些TAA在不同的癌症中都有相对特殊性的表达。因而也成为免疫系统的攻击对象。尽管如此，这些天然（或者通过其他手段制造的）的“抗癌”T细胞的识别能力常常比较弱，因此不能形成对癌细胞的有利攻击。在这种情况下，可以通过部分基因修改的方法来提高这些TCR对相应TAA的“亲和力”和战斗力。“基因修改的TCR”技术也因此被称为“亲和力增强的TCR”技术（Affinity-Enhanced TCR）。这次《自然-医学》杂志报道的就是由美国马里兰大学医学院，滨州大学医学院和目前免疫治疗的“当红炸子鸡”之一：Adaptimmune公司联合研发的一款“基因修改的TCR”。在修改了几个关键氨基酸以后，这些基因修改的TCR大大提高了和一种常见的癌症TAA，NY-ESO-1，的亲和力。从而可以用来进攻有NY-ESO-1过量表达的癌症，比如多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma）。 在这次临床试验中，80%的多发性骨髓瘤患者有了很好的临床应答。其中70%的患者达到完全或接近完全应答。平均无进展生存期达到了19个月。这样的结果可以说是非常惊人振奋的。目前这两种方法，发展都比较迅速，但是都不完美
开发最佳的CAR设计过去的20年中CAR的设计已经取得了长足的进展（图2）。1991年有3个实验室报道了第一代CAR的设计。Kuwana等人最先构造了嵌合受体，使T细胞不依赖于MHC-I类分子识别靶细胞。Roberts、Finney和 Lawson 率先构造了含有CD28或4-1BB共刺激分子的二代CAR。在临床前模型中，使用基于CD28的体外扩增体系，在异种移植瘤模型中 4-1BB比CD28对CAR的功效更有益。两种CAR模型都显示出临床前和临床疗效。Long等人的最近研究表明，基于CD28构造的CAR加强并加速T细胞衰竭，而基于4-1BB构造的CAR减缓了T细胞衰竭。我们的研究结果与其结论一致，并且发现CD28内切域能传递使效应T细胞终末分化的信号。从这些研究中得出的周密的结论并不是说某个人源内切域必然比另一个好，而是说CD28信号是生产有效的临床T细胞制品的关键，而4-1BB提升了CAR-T细胞的持久性。

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图2：CAR-T细胞的设计。第一代CAR引入了CD3ζ链或类似的信号域。基于抗体再定向的T细胞首先由Kuwana设计并由Eshhar完善。Roberts和Finney首先设计了整合CD28或CD137信号域的第二代CARs
为了进一步改良CAR的设计，许多研究组开始着眼于发展第三代CAR，不仅包括“信号1”、“信号2”，还包括了额外的共刺激信号。不同研究者们用不同材料开展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比较结果是矛盾的。不过，新一代CAR-T能有效控制毒性。
透视ACT毒性
十多年来，许多ACT临床试验表明各类工程化的细胞产品相当安全，但有效性相对缺乏。过去的4年里，ACT的疗效发生了一场革命性变化，体现在工程化的T细胞可以在体内大量扩增，甚至在某些情况下可以持续性存活。这彻底的改变了ACT的疗效，尤其体现在CAR-T细胞应用于癌症治疗，但是在显示出疗效的同时，伴随有毒性。
细胞因子释放综合征（CRS）
CAR-T治疗骨髓源肿瘤最显著的毒性是CRS。高度增殖的T细胞能引起CRS，表现为高热和肌痛，不稳定的低血压和呼吸衰竭。这是一个意想不到的结果，因为在临床前动物模型中没有出现类似症状。从CRS观察中发现一个关键的点，除了预期的效应细胞因子INF-γ外，IL-6在CART治疗的细胞指数级增殖期间也会迅速提升。CRS可能直接与另一个毒性相关联，即巨噬细胞活化综合征。幸运的是，针对这些严重的CRS，寻找到了一种治疗方法，应用IL-6受体拮抗剂tocilizumab来阻断IL-6的作用。采用高度增殖的CART治疗ALL患者，确认了IL-6的出现和tocilizumab对严重CRS的疗效，并且我们观察到了双特异性T细胞衔接抗体blinatumomab引起的严重CRS具有类似机制。另一个重要发现是，严重的CRS几乎发生在高疾病负荷病人身上。这意味着将CAR应用于疾病早期患者身上，在疾病恶化之前使用CART来杀灭肿瘤，发生严重CRS风险将大大降低。
关于靶向毒性
T细胞增殖可直接导致CRS。它不依赖于改造的T细胞的抗原特异性，即使CAR是相同的，治疗不同的疾病有可能CRS风险和症状也会有所不同。例如在治疗CLL和弥漫大B时CRS较轻而治疗ALL时CRS相对较重。除了CRS，还存在由工程改造的T细胞的抗原特异性导致的“靶向”毒性。例如溶瘤综合征，它直接是由肿瘤细胞的裂解而导致的。当CARs靶向于B细胞表面表达的靶点如CD19时，会引起B细胞发育不良，这就是一个“靶向”毒性，但却错误的攻击了正常组织细胞的结果。只要CD19 CAR-T细胞长时间存在，B细胞发育不良的情况就不会改善，因此，B细胞缺乏可作为CAR-T疗效持续的标志。B细胞发育不良与CD20特异性单抗治疗一样会造成严重的低丙种球蛋白血症，需要静脉注射免疫球蛋白。不像CD20 单抗 rituximab引起的相对较轻的低丙种球蛋白血症，CAR引起的长期B细胞发育不良，静脉注射免疫球蛋白非常必要。最近报告了输注改造的T细胞引发致命毒性的2个案例，有一例患者接受了HER2-CAR治疗，两例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T细胞治疗。在这2个案例中，均是因为正常组织表达这些靶点，导致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T细胞无法区别表达靶向抗原的正常细胞和肿瘤细胞所致。高亲和力TCR改造的T细胞引起的毒性可能与亲和力成熟过程有关，因为“非肿瘤靶向”的高亲和力TCR的产生在生理条件下将受到限制。在设计TCR的过程中，小心筛选高亲和力的TCRs，并研究其对靶蛋白之外的其他抗原表位的识别显得十分必要。根据已有报道，输注HLA-A2/MAGE-A3特异性的TCR-T细胞能够产生神经毒性。
神经毒性
CAR-T治疗白血病会引起神经系统症状，这是一个预期之外且目前尚不清楚的现象。几个研究小组报道，这些症状具有多样性但可自行消退，如谵妄、语言障碍、运动障碍、缄默症和癫痫发作。虽然与全身CRS的发生有些时间上的关联，当然也与CAR-T存在于脑脊液中相关，但是使用tocilizumab这些症状不会有改变。这些症状的机制与靶组织仍有待确认。
其他毒性
输注活化的T细胞存在引起自身免疫性疾病的风险。靶向黑色素瘤的ACT治疗可诱发白癜风。输注活化的T细胞产生如皮疹、结肠炎、垂体炎等毒性的报道较少。CAR修饰的T细胞尚未出现这些问题。输注同种异体T细胞存在抗宿主移植病的潜在风险。这可能会引起曾接受同种异体造血干细胞移植的患者的担心。幸运的是，从受体采集已耐受供体来源的T细胞（而不是捐献者），抗移植物宿主病的风险会非常低。当然有一种方法是利用自杀系统来限制毒性，如经典的caspase-9 诱导表达系统，或包含特定表面靶点如CD20。在含有caspase-9诱导系统下，一种水溶性活化剂可激活Caspase系统导致T细胞凋亡。包含CD20基因修饰的CAR-T细胞，可用单抗如rituximab来清除“违规”的细胞。
该领域面临的问题
近期实验室研究正在解决在科学与工程方面遇到许多挑战。下面我们谈一谈当前面临的挑战。
细胞制品的构成
早期的细胞治疗主要是输注高分化的CD8+T细胞。这些CTL细胞具有很强的细胞毒性，但是输注后没有足够的复制能力，除了个别情况外，注入患者体内的T细胞持久性较差。目前普遍同时输注CD4+与CD8+T细胞，很可能是因为CD4+T细胞提供生长因子和其他信号以维持输注的CTL的功能和活性。另外，在小鼠中的研究有时候会误导处理人源T细胞的方法。例如，由于受到端粒退化的影响，人源T细胞的复制能力有限，在小鼠模型中却没有这个特点，而人CD4+细胞比小鼠CD4+细胞具有更强的细胞毒性。现在的问题是是否需要利用流式细胞术或其他的方法分离细胞亚群并进行独立培养。CD4+和CD8+T细胞最佳细胞培养条件不同，这因为CD4 +和CD8 + T细胞信号转导途径不一样。此外，细胞分离法可去除对效应T细胞疗法存在潜在危害的Treg细胞。况且，需要从输注的T细胞中去除肿瘤细胞，对白血病患者而言，这尤其具有挑战性。然而，在GMP生产中有些技术使细胞制备成本大大增加，如通过流式细胞术或磁珠分选细胞可使成本迅速增加10000美元甚至更多。
年龄问题
与上述问题相关，输注处于什么分化阶段的T细胞最佳？对小鼠和人类的研究结果表明，naive或中心记忆细胞是最好的。对只有少量naive T细胞的老年人而言，如何获取这类细胞是个挑战，且化疗或其他疾病通常会进一步放大难度。从我们采用CD19 特异性CAR-T治疗白血病患者的数据中表明，扩增能力是预测成功的最重要的生物学标志。一种方法是在全血淋巴细胞中分离中心记忆或naive T细胞。与此相反，一个更简便粗放的方法是使用大量T细胞在特定培养条件下维持naive或中心型记忆细胞的扩增。后一种方法基于特异性共刺激信号可以促使细胞定向分化的原理。如CD28的刺激可使CD4细胞保持中心记忆细胞状态，4-1BB可以促使CD8中心记忆细胞的增殖。相反ICOS共刺激分子可以促使和稳定Th17细胞的生长。利用T细胞的干细胞样特性是非常有希望的，Wnt信号通路的激活可以促进记忆干细胞的增殖。
是否存在统一的最佳细胞制品配方？抑或针对不同的肿瘤需要不同的配方？
CD19 CAR-T治疗B细胞恶性肿瘤显示出的惊人且意想不到的疗效能否出现在治疗实体瘤患者身上还未可知。我们发现CAR-T在体外杀灭低分化腺癌细胞的效率类似于白血病。然而，仍然有待进一步确定是否需要修改细胞组成类型或细胞培养条件，用来优化实体瘤患者体内改造的T细胞的转运和持久性。与恶性血液疾病的散在分布不同，采用细胞工程的方法优化T细胞向实体瘤块转运，如成胶质细胞瘤和胰腺癌，可能会有所不同。已提出一种方法是利用靶向策略，如采用基因工程的手段，使用各种趋化因子或趋化因子受体促使T细胞向肿瘤部位富集。其他方法包括对肿瘤或患者进行预处理，如进行放疗，注射溶瘤载体以及在瘤内直接注射T细胞。
最优的共激活结构域在CD4+和CD8+ T细胞内是一样的吗？
以往研究表明不同亚群的T细胞培养条件是不同的。这就提出一个问题，不同淋巴细胞亚群的T细胞是否需要不同的信号分子进行武装呢？为着手解决这个问题我们对CD4+和CD8+T细胞胞内区CD28, 4-1BB和ICOS进行了评估。在异种移植腺癌的人源化小鼠中，我们发现采用ICOS信号域的CD4+ CAR-T细胞更为优越，而CD8+T细胞常优选4-1BB。如此增加细胞制备的复杂度是否能使临床实验受益尚有待进一步确定。此外，最佳的T细胞亚群比例和信号分子的构造在不同的肿瘤微环境中很可能会有差异。比如在一些临床前肿瘤模型中改造的Th17细胞比Th1细胞更优越。
生存与毁灭：自杀结构能否减弱非肿瘤靶向引起的毒性?
使用改造的T细胞最大的不确定性是利用生物合成技术诱导的新的、增强的细胞效应是否会引发意外的脱靶毒性。CAR-T细胞的非肿瘤靶向毒性和TCR细胞的脱靶毒性被格外关注。有多种方法可以缓解这些问题。我们发现利用编码CAR的mRNA转染T细胞，限制CAR仅在转染T细胞中表达，对评估出现的直接毒性有帮助。当出现毒性反应，停止细胞输注，毒性会迅速减弱。研究人员也提出了许多诱导基因修饰T细胞凋亡的方法。这些方法很可能都会被整合，以便按需清除T细胞，满足严格的安全需求。
结论
基于正在进行的试验，表达CARS和TCRS的T细胞已经为广泛的商业应用准备就绪。华尔街的资源正推动这个曾因投资不足而被限制的领域的进步。在输注的T细胞中引入或删除基因，提供了能克服肿瘤免疫抑制微环境的新细胞制品，并且最后可能不需要使用免疫检查点封闭抗体。ACT先进的基因工程技术的到来，将会使利用合成生物学原理进行癌症、慢性感染和自身免疫性疾病的治疗取得显著进展。