关于无菌检查法阳性对照 附方法适用性试验方案

aox97

1、首先说概念。

至CP2015版始，无菌检查方法验证试验改为方法适用性试验，随着这一概念变化，原来文中“验证”的说法也随之改为“确认”，例如：对每一试验菌应逐一进行方法确认。

上述改变，意味着原本侧重于验证方法本身的科学性，转变为确认供试品特征+药典方法在各实验室检验条件下的运行。薄膜过滤法原理的逻辑远大于直接接种法，普遍推广，更侧重于供试品特征与方法在实际条件下的评价，这个转变是正确的。

2、方法适用性试验用菌。

采用代表性或苛刻性微生物。以大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌，是因为作为革兰阴菌代表的铜绿假单胞菌对某些头孢菌素不敏感，而大肠埃希菌对此更敏感，基于此种考虑，考察供试品抑菌性选择阴性菌代表时应选择大肠埃希菌，更容易考察出供试品的抑菌性。

3、生物制品无菌检查中供试品阳性对照的供试品用量

CP1101规定了生物制品无菌检查接种FTM在高低两个温度下培养，就这是俗称2:1三联过滤培养，这是因为生物制品无菌检查可能存在于较低温度培养条件下长菌情况（注意usp等并无FTM分置高低温培养，也无随行供试品阳性对照）。在此规定下，生物制品取样量要增加1份。那么，随行抑菌对照的供试品阳性是否应该也是这么做呢？

有人把“（阳性对照的）供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量”这句话，理解为供试品无菌检查接种3份培养基（2:1），那供试品阳性对照也应该如此，照着无菌检查重取同量的供试品过3份，再每份加金葡2:1培养。

这个理解是没有考虑1101开头的培养基章节。如果对照菌是金葡菌，金葡菌这种嗜温型微生物的适宜生长温度是20-40度，适宜FTM培养基，在最佳温度和条件下培养，才是供试品阳性对照考察随行抑菌性的目的。金葡菌在20-25条件下生产微弱，那么到底是培养条件造成的，还是供试品具有抑菌性？

供试品+金葡菌对照，只需一份，在金葡菌最佳培养条件下培养即可。在食品行业微生物检查中，金葡菌的培养温度要略高于药典（35度），是考虑了金葡菌的特征。药典实践选择了金葡菌30-35度培养也可以获得良好的培养结果。

理解的关键是：供试品的无菌检查是未知微生物，把适合厌氧菌（首选）和需氧菌生长的FTM置于高低两个温度培养，把TSB置于真菌和需氧菌最佳温度培养，是基于最大检出的原则，但供试品阳性对照是加入的已知菌，其目的是随行抑菌性确认，加入菌的最佳培养条件是已知的，并不需要在该菌种较差的条件下培养。实际操作也非常能说明：金葡菌在20-25条件下生长微弱，这就不能判断供试品存在抑菌性。

理解“（阳性对照的）供试品用量同供试品无菌检查时每份培养基接种的样品量”，就是：加入金葡菌阳性对照的供试品用量同无菌检查时 每 份 培 养 基 接种的样品量，金葡只需接入一份培养基。（在FTM30-35培养，既不需要在FTM20-25度培养，也不需要TSB20-25度培养）

4、附方法适用性试验方案示例。

方法适用性试验应该采用最敏感菌，最苛刻试验条件，例如最大的检验量、最少的冲洗量。

附录的方案只供参考，实践中也可以根据供试品特征设置梯度冲洗量。

对于试验菌的加入，CP提供了一种理想型的操作方法，即把菌液加入最后一次冲洗液中过膜，实践中这个操作比较麻烦，一般带菌操作在生物安全柜进行，生物安全柜操作空间是否容纳集菌过膜操作是个问题。CP可能是考虑尽可能让菌截留在膜上然后再加培养基，但实际操作是先加培养基，再在阳性室做加菌操作。

另外需注意，FTM培养时间是不超过5天，并未明确是3天还是5天，这是因为充分考虑到可能存在的抑菌性造成试验组和对照组的长菌差异。不应该被培养基灵敏度检查或平板计数检查规定的培养天数束缚，通常来说3天足够，但供试品抑菌性尚未确认前，不超过5天是更适合的表述。

是否附培养比对结果照片，个人认为无需此照片，但是很多单位在验证管理中习惯用照片做结果证明。实际上，照片应该为直观的展示某些文字描述不尽的情况，例如装载方式。无菌检查结果，是容易用文字表述的，何况对培养结果进行拍照用以证明验证结果，也几乎不能防止编造结果的情况，编个符合预期结果的照片还不容易？

附文如下：

目的：xx无菌检查法适用性试验，以确认供试品是否存在抑菌作用。

概述：本品为xx,含xx,拟以博膜过滤法进行无菌检查，新建xx无菌检查（操作规程草案），为确认该供试品的抑菌性，取3批供试品进行方法适用性试验。

验证内容和方法（标题最好写作无菌检查法适用性试验，考虑到不少单位验证管理，延续这一命题。本文以液体供试品为例，如果是固体，还应考虑稀释液及梯度稀释，本文所涉的液体供试品预设没有抑菌性，因此只采用了常规冲洗量，并未设置梯度冲洗量）

1.1 项目：供试品的抑菌性（适用性试验）。可接受标准：3批供试品在实验条件下对6种代表菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。

1.2 菌种及菌液制备

1.2.1 菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，生孢梭菌[CMCC(B)64941]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]，黑曲霉[CMCC(F)98003]。本验证使用上述菌种传代的菌株，不超过5代。

1.2.2 菌液制备：分别（用接种环挑取）取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物，各接种至胰酪大豆胨液体培养基中，取生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，以上4菌于30～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养48～72小时，上述5种培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天或获得丰富的孢子，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/m l）聚山梨酯80的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。上述菌悬液若在室温下放置，一般应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。

1.3 供试品：以无菌器具取供试品，共3批，每批至少取样量60ml。（生产批量大于10升，接种每培养基的检验量按每储存容器的0.1%计）。

1.4 试验管(供试品阳性)：取本品至少60ml，以集菌仪吸至6个集菌管中（每管10ml），滤过（滤膜预先以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液润湿）。以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每膜100ml，滤过。在其中3管中加硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，密封集菌管，移入阳性室，再分别加不大于100cfu/ml的①金黄色葡萄球菌、②大肠埃希菌、③生孢梭菌菌悬液各1ml，记为FTM①②③；在剩余3管中加胰酪大豆胨液体培养基各100ml，密封集菌管，移入阳性室，再分别加不大于100cfu/ml的④枯草芽孢杆菌、⑤白色念珠菌、⑥黑曲霉菌悬液各1ml，记为TSB④⑤⑥。此6管作为验证管。

1.5 对照管（阳性对照）：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液600ml，以集菌仪吸至6个集菌管中（每管100ml），滤过。在其中3管中加硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，密封集菌管，移入阳性室，再分别加不大于100cfu/ml的(1)金黄色葡萄球菌、(2)大肠埃希菌、(3)生孢梭菌菌悬液各1ml，记为FTM(1)(2)(3)；在剩余3管中加胰酪大豆胨液体培养基各100ml，密封集菌管，移入阳性室，再分别加不大于100cfu/ml的(4)枯草芽孢杆菌、(5)白色念珠菌、(6)黑曲霉菌悬液各1ml，记为TSB(4)(5)(6)。此6管作为对照管。

1.6 培养：上述硫乙醇酸盐流体培养基各管于30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基各管于20～25℃，培养不超过5天，培养时间从起始当天上/下午至结束当天上/下午。逐日观察，将结果记录在附件《xx无菌验证记录》（根据情况附培养结果照片吧，无必要）。

1.7 结果判断：与阳性对照管比较，如含供试品各管中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，则方法适用性试验通过。如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。

1.8 附表

冲洗液:pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液配制批号 集菌培养器批号

培养基:FTM配制批号 TSB配制批号

培养时间:年月日时-年月日时

供试品批号			培养结果（天）					对比结果
试验菌	管号	培养温度	1	2	3	4	5
金黄色葡萄球菌 cfu	试验管FTM①	[size=9.0000pt]培养温度[size=9.0000pt]30~35℃ 培养箱						¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管FTM(1)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
大肠埃希菌 cfu	试验管FTM②							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管FTM(2)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
生孢梭菌 cfu	试验管FTM③							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管FTM(3)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
枯草芽孢杆菌 cfu	试验管TSB④	[size=9.0000pt]培养温度[size=9.0000pt]20~25℃ 培养箱						¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管TSB(4)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
白色念珠菌 cfu	试验管TSB⑤							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管TSB(5)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
黑曲霉 cfu	试验管TSB⑥							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌
	对照管TSB(6)							¨良好¨较弱¨较慢¨无菌

“－”表示无菌生长,“＋”表示有菌生长，同菌种两管比较，若菌生长弱的管，还应在“＋”后记录“弱”。在结论栏，根据对比观察的情况，选择生长良好、生长较慢、生长较弱、无菌生长。

结论：供试品对金黄色葡萄球菌抑菌作用、对大肠埃希菌抑菌作用、对生孢梭菌抑菌作用、对枯草芽孢杆菌抑菌作用、对白色念珠菌抑菌作用、对黑曲霉抑菌作用。

思恋

学习了学习了

燕子530

学习了学习了+1

暖阳时光

、[size=9.0000pt][size=9.0000pt][size=9.0000pt][size=9.0000pt]枯草芽孢杆菌抑菌作用、对白色念珠菌抑菌作用、对黑曲霉抑菌作用。

xqliu

学习了，谢谢提供分享。

18377713055

方法适用性试验应该采用最敏感菌，最苛刻试验条件，例如最大的检验量、最少的冲洗量。
你好，这段话在实操中我是否能简短的理解为，在相同的检验量冲洗量的前提下，然后选择生长趋势最好最快速的菌，作为样品的阳性对照菌。

呆呆戴

学习了，谢谢老师！

救命啊

你好，想请问菌液制备中各液体培养基多少ml呢

来自安卓APP客户端

aox97

18377713055 发表于 2023-5-20 16:00
方法适用性试验应该采用最敏感菌，最苛刻试验条件，例如最大的检验量、最少的冲洗量。
你好，这段话在实操 ...

应该理解为最苛刻或最具挑战性的即对供试品的抑菌性能最敏感的菌种。
并不是说长势最快最好的菌

aox97

救命啊 发表于 2023-5-23 10:28
你好，想请问菌液制备中各液体培养基多少ml呢

看集菌器的体积啦，一般100ml

Pumbaa_

生物制品无菌检查阳性在培养14后加菌，阴性对照培养基也要加菌？或是不加阴性还要跟着阳性一起培养？

Cora12

学习了，谢谢老师！

古拉大人

请问老师，方法适用性有必要做阴性对照么

想不想的天平

老师，无菌方法适用性，不需要有供试品组/阴性对照组吗？
如果需要，供试品组/阴性对照组的培养时间是5天？还是14天？

aox97

想不想的天平 发表于 2023-12-17 14:26
老师，无菌方法适用性，不需要有供试品组/阴性对照组吗？
如果需要，供试品组/阴性对照组的培养时间是5天 ...

无菌方法适用性，考察的正是供试品对代表菌生长是否存在抑制干扰。因为试验的目的是比较，你首先选取的是无菌供试品，也就是预实验要确定产品无菌，你做供试品组，比较什么呢。阴性对照可加可不加，这个试验的目的不是考察固有的试验条件。中国药典已经把适用性试验写得很清楚了。

aox97

古拉大人 发表于 2023-12-13 11:00
请问老师，方法适用性有必要做阴性对照么

无菌方法适用性，考察的正是供试品对代表菌生长是否存在抑制干扰。因为试验的目的是比较，你首先选取的是无菌供试品，也就是预实验要确定产品无菌，你做供试品组，比较什么呢。阴性对照可加可不加，这个试验的目的不是考察固有的试验条件。中国药典已经把适用性试验写得很清楚了。

aox97

Pumbaa_ 发表于 2023-8-1 09:10
生物制品无菌检查阳性在培养14后加菌，阴性对照培养基也要加菌？或是不加阴性还要跟着阳性一起培养？

试验不能无限制扩大。阴性培养基本身是已通过符合性检查，阴性对照的意义是代表整个试验，而不能理解为单一孤立的，无需再加菌做培养。

没那么一波简单@

1.无菌检查: 培养基适用性检查___菌种用金,铜绿,枯草,生孢,白念,黑曲霉,
                  2.无菌检查:   方法适用性检查___菌种用金,大肠.枯草,生孢,白念,黑曲霉,
                  3.微生物限度检查:计数培养基适用性检查___菌种用金,铜绿.枯草,生孢,白念,黑曲霉,
                  4.微生物限度检查:计数方法适用性检查___菌种用金,铜绿.枯草,生孢,白念,黑曲霉,

zbobo

没那么一波简单@ 发表于 2024-4-3 16:24
1.无菌检查: 培养基适用性检查___菌种用金,铜绿,枯草,生孢,白念,黑曲霉,
                  2.无菌检查: ...

微生物限度检查需要用生孢吗？药典好像没提到

wpc940917

方法学适用性需要做平行管吗？