环境监控平皿培养时是否要套呼吸袋？

luckylala

最近两个月一直接收到环境监控后的平皿在培养箱里培养需要套呼吸袋这样的说法，老实说我一开始觉得挺不可思议的，这个情况基本都来源于生产质疑QC的监测数据，比如培养箱风机把菌吹进了培养的平皿中，甚至有老师说实验做出这样的结果，上周末，有一位药企的老师给我发了四个问题，完全是针对这个问题问的，我把我自己的观点贴上来，希望大家一起探讨一下这个事情到底怎么做更科学，问题如下

问题1、AB级环境监测碟从车间传递到QC，传递是用呼吸袋密封好的，回到QC培养箱培养还需要打开呼吸袋敞口培养吗？
问题2、培养箱每个月用75%乙醇清洁消毒一次，频次还要加密到每周吗？培养箱内污染培养碟可能性有多大？
问题3、一次性碟用真空包装，会影响如碟本身有的霉菌或需氧菌的生长吗？还是要改成有空气正压的一次性培养碟？
问题4、AB级环境碟您那边是逐日观察，还是到5天或7天时仅观察一次？


我的回复
1、环境采样平皿到培养箱还是需要从袋中取出倒置培养的，原因如下：
A、TSA是需氧菌培养培养基，因此碟子拿出来利于培养基接受比较均衡的培养温度、湿度和空气环境，更利于需氧菌生长
B、有袋子的碟子里和袋子内侧容易出现水汽，环境就和温室养植物一样，每块培养皿的湿度不一定那么均一，而且培养皿里如果有水是大忌，不论多无菌都有污染风险，另外容易造成菌体连片生长（如一些芽孢菌本身长比较大），难以计数
C、药典培养的时间就是基于大多数需氧菌在该培养温度下的生长速度和培养基的失水状况而定，这是微生物培养皿的最经典培养状态
需要注意的是采样完成到从袋子取出的过程动作熟练不引入污染即可

有人提出呼吸袋可以对流，那车间那些灭菌的物品为什么还套呼吸袋湿热灭菌？贮存时可以空气流通但如果没有外部烘箱烘，里面的内层水汽根本无法去除，如果按道理说的空气和氧气流通，那能确保微生物阻隔吗？这个是不是个悖论？我觉得在一定的外部压力下是可以保证的，那必须要做此呼吸袋包装形式和摆放密度在这个培养箱的风速对流测试，能证明培养皿内微生物能达到所谓的培养氧气需求，同时呼吸袋的tyvek面如何放置能确保前后不干预空气对流，这个也是需要确认的。使用呼吸袋的初衷是以防污染及便利来提，并非以利于微生物生长角度，这个是伪命题，我们检验样品首先是检出样品中的微生物，其中有一个措施是防止外来微生物的污染以避免干扰检品的真实数据。


2、培养箱内污染可能性极小，但需要注意
A、阳性菌和供试品的培养箱是分开的，简而言之就是主动接菌的样品和检验里面是否有微生物的样品需分开培养箱培养
B、定期清洁培养箱需要明确擦拭的位置，其实不用酒精都没有问题，但是要擦干净，比如风机的叶片可以一月一次，基本里面不要会有什么灰尘，但是需要注意的是培养箱在满载温度分布的时候，培养箱每层放平皿是有范围和高度的，否则腔体内某些位置可能达不到，我们会在培养箱里每层贴个框并标记高度，在培养箱后端都会离风口有一定距离，因为那里容易导致平皿失水比一般的严重不利于菌生长

3、真空包装就是“保鲜”、防污染，主要保证培养基的营养成分和水分，这个没什么影响，现在市面上基本都是真空包装的，至少最内部肯定是，适用性检查没问题就没问题，环境菌其实不会对生长那么苛刻，除非真的中头彩了，这方面不用太纠结
有平皿厂家说真空包装会影响，用呼吸袋空气正压的能帮助我们提前发现问题，这个是针对药典培养皿删除预培养提出的解决方案，我认为真空和正压都可以用，主要是确保无菌和灵敏度合格，如果正压贵不少，那就完全没有必要。。

4、建议逐日观察，因为一旦超标第一时间知道，另外也是最重要的，真的发生污染事件要调查，菌生长出的时间确认非常重要，这是判断污染菌在环境中的状态的指征，也为后续鉴定污染菌作判断依据。有些菌如芽孢长很大，培养末日观察会造成无法计数，可能只有一个，但整块板都生长蔓延了，对于结果无法正确判断，所以我个人始终对于“懒得观察”持不怎么赞成的意见，现在药典是删去逐日，权力放归企业，但是可控是前提，微生物这东西原本就是不太可控的，特别对于无菌制剂还是应持谨慎态度。


回到原点，微生物生长需要什么，产品检验的目的是什么，我们如何控制，而不是因为控制去苛刻真正适宜的生长环境，现在我们是在找理由用呼吸袋，貌似是防污染，用了呼吸袋然后无法逐日观察又去挑战5天7天，因为逐日又要拆装袋，其实大可不必，你说风机污染，咱们不能说百分百没可能，但是概率极低，这就和人员操作可能的失误和偏差一样，我们不是因为这个所以就不让人操作了这个道理是一样的，微生物为什么现在的标准更科学，比如用指数形式放在微生物限度的标准，这个数字已经考虑了微生物实验的所有偏差，这个偏差高达20%，所以我觉得不能陷入误区，这是个很科学的东西，最终目的是检出，防控只是手段。

以上是我当时和这位老师探讨的观点，我也很想听听大家的观点，现在很多企业真的就是套呼吸袋在培养，然后培养到最后一天才拿出来点检，如果真的是因为怕拿进拿出污染，其实锻炼操作手法即可，非常简单，但是这样的培养方式到底是否科学？期待大家一起探讨一下！

云水风度1

关键还是要强化实验人员的规范操作，现在人门总是愿意用最省事的方法没有问题，但是不能忽略基本实验要求。

wsx

普通条件下进行培养，风险可控。但是就有那么些人觉得风险高，实际上是理论上的。实践证明风险可接受，因为就全球而言，阴性对照各家都做了无数次，这些数据几亿次都应当不止了吧。

阿容

套呼吸袋培养, 防送样时污染, 防培养室生产怀疑的可能污染。我们一直这么做,出的结果生产心服口服

大呆子

找了半天这个帖子

amai212

1)我个人觉得 你是套着呼吸袋出来的 那就套着去培养吧   倒置的目的还是防止水蒸气击散菌落  AB级要求高  长了菌基本也可以判不合格了。

2）我是培养完一轮就要清洁一下，以前不注意清洁 一个月酒精喷一次，然后有次培养箱污染了霉菌，真的倒了血霉 ，两三个礼拜都没办法正常实验。

3）我觉得没差 会长菌的一次性碟厂家该被拉进不合格供应商。

4）这种应该每天 ，像你说的 第一时间要发现。及时应对


最主要的还是规范操作 ，然后从知识 和经验储备上碾压提出问题的人。

luckylala

阿容 发表于 2021-1-7 08:55
套呼吸袋培养, 防送样时污染, 防培养室生产怀疑的可能污染。我们一直这么做,出的结果生产心服口服

那请问何时点检数据？

mulunmulun

没有必要                              

yddjh

呼吸袋高压蒸汽可以穿透，在正常条件下是不呼吸的吧？可以试试把呼吸袋扎口，就和正常塑料袋一样，空气出不来。

聂春明

阿容 发表于 2021-1-7 08:55
套呼吸袋培养, 防送样时污染, 防培养室生产怀疑的可能污染。我们一直这么做,出的结果生产心服口服

套着袋就不可能逐日观察

阿容

聂春明 发表于 2021-1-11 13:38
套着袋就不可能逐日观察

套袋再逐日观察确实会导致QC操作流程复杂度增加，且污染机率增大。

阿容

luckylala 发表于 2021-1-9 15:17
那请问何时点检数据？

逐日点检。 点检频率高，确实会给QC带来很多开盖污染的可能；但为了不出现无法计数的情况以及及时发现超限情况，与生产讨论，他们还是愿意QC逐日点检。

luckylala

yddjh 发表于 2021-1-11 13:18
呼吸袋高压蒸汽可以穿透，在正常条件下是不呼吸的吧？可以试试把呼吸袋扎口，就和正常塑料袋一样，空气出不 ...

我觉得至少袋子里面并不是一个良好的空气环境

发呆DZH

围观围观                          

ddnyzaideng

感谢楼主开贴，正愁没地方找线索。

灰灰1

我们领导还想让AB级培养皿在无菌环境下培养，事实上很难做到。正好有这个帖子，想看看大家觉得AB级培养皿无在菌环境下培养的必要性。