基于质谱的蛋白质O-糖基化分析

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作者：斯坦德生物医药（BLA会员单位）

生物体内的糖基化修饰越来越受到关注，糖基化修饰主要分为N糖和O糖。对于哺乳动物而言，常见的O糖以连接在丝氨酸或苏氨酸的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）为基础，在酶的作用下进一步转移半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺等糖基，从而形成四种核心结构。在这四种核心结构的基础上，已合成的糖苷还可以在酶的作用下进一步转移岩藻糖、唾液酸等糖基，从而形成更复杂的O糖[1]。

含有O-GalNAc的糖蛋白在传统上被定义为粘蛋白或粘蛋白样蛋白。粘蛋白携带密集的O-GalNAc糖簇，亲水且带负电的O-聚糖易形成具有润滑作用的高度水合致密阵列，并作为抵御病原体和物理或化学损伤的保护屏障，因而常在呼吸道等各种器官的粘膜上表达[2]。而最近，O-GalNAc被发现广泛分布在许多不具有粘蛋白样特质的蛋白质上。这些O糖在细胞中具有特殊功能，包括激素调节、脂质代谢和生长因子、信号转导等[3]。部分研究者对果蝇的多肽α-N乙酰半乳糖胺转移酶基因进行RNA干扰，发现果蝇特定的形态和功能效应受到影响，说明了发育过程中位点特异性O-糖基化的重要性[4]。

随着质谱表征技术的更新换代，对各类生物体内的蛋白组和重组蛋白药物研究逐渐深入，许多非常规O糖修饰也得到了多角度的确证。例如当下表达抗体最常使用的CHO细胞，其表达的重组人IgG1轻链上的O-岩藻糖修饰[5]，重组人IgG2轻链上的O-甘露糖修饰[6]等陆续被发现。针对这些非常规O糖对药物安全性和有效性的研究还在进行中，未来也可能会有更多非常规O糖修饰被揭晓。

与蛋白质的合成不同，O糖合成过程没有固定的模板遵循，O糖缺乏N糖的基序（NXS/T），因此在位点和糖链结构两个层面常具有较强的异质性。而随着对O糖生物学功能认识的深入，对O糖的深度表征也越来越得到生物制药从业者的关注。
斯坦德生物医药大分子实验室选用S-Bio公司的EZGlyco O糖制备试剂盒，以最小化非特异性O糖β消除反应。通过糖捕集珠除去蛋白和其他杂质，以便后续标记。荧光试剂标记后的O糖经除盐处理后即可上机分析。借助高效液相系统和高灵敏度的质谱仪，我们能在较短的实验周期内对标记后的O糖进行高置信度的确认。

参考文献

[1]Joanne Chia, Germaine Goh, Frederic Bard. Short O-GalNAc glycans: regulation and role in tumor development and clinical perspectives.

[2]Barry D Shur, Michael A Ensslin, Carey Rodeheffer. SED1 function during mammalian sperm-egg adhesion.

[3]Katrine T.-B.G. Schjoldager, Henrik Clausen. Site-specific protein O-glycosylation modulates proprotein processing —Deciphering specific functions of the large polypeptide GalNAc-transferase gene family.

[4]Liping Zhang, Kelly G. Ten Hagen. Dissecting the Biological Role of Mucin-type O-Glycosylation Using RNA Interference in Drosophila Cell Culture.

[5]John F Valliere-Douglass, Lowell J Brady, Chris Farnsworth, et al. O-Fucosylation of an antibody light chain: Characterization of a modification occurring on an IgG1 molecule.

[6]Theresa Martinez, Danielle Pace, Lowell Brady. Characterization of a novel modification on IgG2 light chain Evidence for the presence of O-linked mannosylation.

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