蛋白质浓度定量检测方法之 Lowry 法

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蛋白质含量测定是生物技术药物质量控制的重要指标之一，Lowry法是一种蛋白质含量定量检测的经典方法，应用较为广泛，适用于鉴定蛋白纯化效果并进行活性测定，Lowry 法和BCA方法可用于测定纯化多糖中蛋白杂质的含量。蛋白分离和蛋白纯化技术在生物化学研究应用中较为广泛，因为为了研究某一个蛋白质，需要首先将这个蛋白质从其他蛋白质分子中分离纯化出来。

在生物技术药物研发领域，蛋白质含量测定的准确性对于产品规格、分装量具有指导意义，是比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定的基础，也是临床前安全和有效性评价研究中有效剂量、毒性剂量设置以及临床方案制订的重要依据。Lowry 法测定蛋白质含量的原理是蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+鳌合，形成蛋白质-铜复合物，还原酚磷钼酸，产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系，在一定条件下，蓝色深度与蛋白量成正比。

使用Lowry 法测定蛋白质含量的优点是，该方法较为常用、灵敏度高，较双缩脲法更灵敏。缺点是它存在专一性较差，干扰物质多（如Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类和柠檬酸等），标准曲线的直线关系不特别严格。大量纯化的重组蛋白可用于药物筛选、结构生物学研究、细胞生物学研究、蛋白质组学等的一系列生物医学领域的研究。美迪西已成功构建完整的大肠杆菌原核和酵母细胞真核的蛋白表达技术平台，并可以根据客户的需求，提供从蛋白表达质粒的构建、蛋白表达条件摸索和蛋白纯化等一整套服务。

血红素加氧酶(HO)是组成微粒体酶系统的重要组分之一，它能催化降解血红素生产胆红素、游离铁离子和一氧化碳。HO有3种同工酶:HO-1、HO-2、HO-3。HO-2主要分布于大脑、视网膜、神经系统等组织中。为了获得具有生物学活性的纯化的血红素加氧酶-2进行研究，可采用大肠杆菌表达系统进行表达，采用采用一些纯化分离技术获得纯化的目的蛋白，再采用Lowry法等方法鉴定纯化效果并进行活性测定。

有研究者将将重组的血红素加氧酶-2在大肠杆菌中表达并纯化，该研究者将构建的血红素加氧酶-2(HO-2)的重组质粒pMW172a/HO-2转入大肠杆菌BL-21,研究培养温度、摇床转速对HO-2蛋白表达的影响,确定可溶性表达的最佳条件;通过超速离心、分级盐析、层析等方法纯化目的蛋白;采用SDS-PAGE、Lowry法、光谱扫描等方法鉴定纯化效果并进行活性测定[1]。结果获得了纯度较高有活性的目的蛋白,为进一步进行HO-2结构与功能之间关系的研究提供了可行纯化路线。

Lowry法在测定蛋白质含量方面应用较为广泛，还有研究者试验验证了Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法,为后续试验提供重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的检测方法[2]。研究者以蛋白含量测定国家标准品为标准品,在100~0μg/m L浓度范围内建立标准曲线,线性关系良好,相关系数(R~2)大于0.99。标准曲线上至少6点(包含两端)满足准确度介于95.2%~111.67%,标准曲线下限准确度介于95.98%~103.6%。高、中、低质量浓度(80,40,20μg/m L)质控样本批内精密度均介于1.51%~4.41%,批间精密度均介于3.83%~6.36%。综合上述信息,Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法稳定,可重现。

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。蛋白质的含量测定是实验室的基础性操作，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在测定蛋白质含量时还需要综合考虑多种测量方法的优缺点，进而选择合适的测量方法。

[1]重组血红素加氧酶-2在大肠杆菌中的表达及纯化[1].

[2]Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法验证[2].

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