PBMC复苏后聚团严重，有大佬帮忙分析一下原因吗？

逃跑的榴莲

做的羊的PBMC，冻存之前细胞状态很好，0.4%台盼蓝染色细胞活率也比较高，冻存液自配，血清：DMSO=9：1，程序降温盒放入-80°冰箱后一夜，第二天复苏后细胞聚团严重，肉眼可见浑浊沉淀，无法上机器检测。

Chowvine

复苏过程中 吹打细胞了吗？

逃跑的榴莲

Chowvine 发表于 2024-7-16 16:27
复苏过程中 吹打细胞了吗？

前辈，复苏过程中，肯定会吹打细胞，但是吹打后仍然会出现聚团的现象。

Chowvine

逃跑的榴莲 发表于 2024-7-16 16:32
前辈，复苏过程中，肯定会吹打细胞，但是吹打后仍然会出现聚团的现象。

冻存前细胞密度多少？冻存前细胞密度太高 会容易粘连成像组织一样的东西。

逃跑的榴莲

Chowvine 发表于 2024-7-16 16:39
冻存前细胞密度多少？冻存前细胞密度太高 会容易粘连成像组织一样的东西。

前辈，冻存前会进行细胞计数，冻存浓度在1~2×10的7次方。也尝试过更低浓度进行冻存，1×10的6次方，但是结果仍然一样。

Chowvine

感觉像是培养过程中，细胞密度太高了 长在一起了 不知道你冻存前有没有发现有这种粘连在一起的情况，如果有 肉眼应该可以看到小团块或者絮状的东西。 一般这种连在一起的都长不好 冻存或者培养传代过程中会弃掉。 我们之前养干细胞经常有这种情况，传代传的晚了就会有

Lily_VIP

知识盲区，只能学习学习了，感谢楼主的金币，以下是AI的回复，可以参考看看，不晓得有没有用
遇到您描述的PBMC（外周血单核细胞）冻存后复苏出现聚团严重以及浑浊沉淀的问题，可能有以下几个原因：
1. **细胞类型**：
   - PBMC这类细胞通常比较脆弱，在冻存和复苏过程中容易受到损伤。
2. **冻存液配方**：
   - 您使用了自配的冻存液，血清与DMSO的比例为9:1。这个比例是常见的，但有时候需要根据细胞类型调整DMSO的浓度。DMSO浓度过高或过低都可能导致细胞损伤。
3. **冻存速度**：
   - 使用程序降温盒能够控制冻存过程中的降温速率，这对于细胞的存活至关重要。如果降温速度太快或太慢，都可能导致冰晶形成，损伤细胞膜。
4. **复苏过程**：
   - 复苏时应迅速将冻存管从液氮或-80℃取出并立即浸入37℃的水浴中，以快速融化避免冰晶再次形成。缓慢的融化过程会导致细胞损伤加剧。
5. **机械应力**：
   - 在冻存和复苏过程中，细胞可能会遭受机械应力，如剧烈的摇晃或不适当的处理，这也会导致细胞损伤。
6. **污染**：
   - 浑浊可能是由于细菌或真菌污染造成的。在冻存前和复苏后，应该检查是否有污染的迹象。
7. **细胞密度**：
   - 冻存时的细胞密度也很重要。如果细胞过于密集，复苏后聚团的可能性会增加。通常建议的冻存密度为1-10 x 10^6 cells/mL。
8. **细胞年龄**：
   - 细胞的年龄和健康状况也会影响冻存效果。老化或处于压力状态的细胞在冻存后更易受损。
为了改善复苏后的细胞状态，您可以尝试以下措施：
- 调整冻存液中的DMSO浓度，比如增加到10%或者使用商业化预配制的冻存液。
- 确保冻存和复苏过程中的温度控制严格。
- 在冻存前确保细胞状态良好，活率高，没有污染。
- 在复苏后，温和地离心细胞悬液，去除上清液中的死细胞碎片，然后用新鲜培养基重悬细胞。
- 考虑使用G-CSF或其他生长因子来促进PBMC的恢复和增殖。
如果问题仍然存在，可能需要进一步的实验优化和排除其他潜在的变量。

逃跑的榴莲

Lily_VIP 发表于 2024-7-16 19:54
知识盲区，只能学习学习了，感谢楼主的金币，以下是AI的回复，可以参考看看，不晓得有没有用
遇到您描述 ...

大佬，这分析的很全面了！

Lily_VIP

逃跑的榴莲 发表于 2024-7-17 08:07
大佬，这分析的很全面了！

哈哈哈只有AI才会这么全面，呵呵……希望有用，感谢支持

20211023

不太懂