关于狂犬病疫苗

毒手药王邓智先

关于狂犬病疫苗         
一、狂犬病疫苗是如何发明出来的 
  法国微生物学家、化学家巴斯德(Louis&#160asteur，1822-1895)是近代微生物学的奠基人。像牛顿开辟经典力学一样，巴斯德开辟了微生物领域。 
  巴斯德是19世纪最有成就的科学家之一，他一生进行了多项探索性的研究，证明了三个重要的科学问题： 
  (1)每一种发酵作用都是由于一种微菌的发展，他发现用加热的方法可以杀灭那些让啤酒变苦的恼人的微生物。很快，“巴氏杀菌法”便应用在各种食物和饮料上。 
  (2)每一种传染病都是一种微菌在生物体内的发展：由于发现并根除了一种侵害蚕卵的细菌，巴斯德拯救了法国的丝绸工业。 
  (3)传染疾病的微菌，在特殊的培养之下可以减轻毒力，变成防病的药苗。他意识到许多疾病均由微生物引起，于是建立起了细菌理论。 
  1889年巴斯德发明了狂犬病疫苗，可使人抵御可怕的狂犬病。其他科学家应用巴斯德的基本思想先后发展出抵御许多种严重疾病的疫苗，如预防斑疹伤寒和脊髓灰质炎等疾病的疫苗。虽然在他之


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前英国医生琴纳发明了牛痘接种法，但有意识地培养、制造成功免疫疫苗，并广泛应用于预防多种疾病，巴斯德堪称第一人。 
二、我国人用狂犬病疫苗有多少种？ 
   我国在1980年以前均生产羊脑制备的经石炭酸灭活的疫苗(也曾制备乙醚灭活疫苗)，为解决人用脑组织狂犬病疫苗接种后的神经合并症和效价低的问题，我国有关单位于1980年研制成功1种原代地鼠肾细胞培养疫苗，近年来又研制成功一种velo细胞培养的疫苗。 
  一、原代地鼠肾细胞疫苗(PHKCV) 
  由卫生部武汉生物制品研究所牵头，中国药品生物制品检定所，卫生部长春、兰州生物制品研究所等单位合作于1965年开始用狂犬病固定毒北京株通过原代地鼠肾纳胞遇应传代，研制成功一种原代地鼠肾细胞培养灭活疫苗。原代疫苗再经超滤浓缩是为浓缩疫苗，若再经过纯化步骤，则成为纯化疫苗。我国在2002年已经停用浓缩疫苗而改用纯化疫苗，目前使用的都是纯化疫苗。 
  二、vero细胞狂犬病疫苗 
  近年来我国已研制成功以Vero细胞为基质的纯化狂犬病疫苗。Vero细胞由中国药品生物制品检定所从美国ATCC引进，经全面检定，符合要求后提供给厂家，细胞代次在126左右。用于生产vero细胞疫苗的毒种，经国家药品监督管理局批准的有二株，一株为生产地鼠肾细胞疫苗的aG株，另一株为CTN-1株。 



  


三、原代细胞狂犬病疫苗是如何生产出来的？  
  生产用毒种的培育毒种的传代适应培育分以下三个阶段：   第一阶段，用北京株兔脑固定毒感染2~3周育龄地鼠肾单层细胞，置36～37℃培养两周左右(其间换液1～2次)，弃去上清液，将感染的地鼠肾细胞单层，经胰酶消化做成细胞悬液加适量正常新鲜制备的地鼠肾细胞悬液，混合后再培养两周。然后再按上法以胰酶消化，加正常原代地鼠肾细胞继续培养(此法称混合培养法)，如此培养连续传四代，病毒滴度达102～103／0.03mlLD50。 
  第二阶段，将上述第四代病毒液直接种入5天左右的正常地鼠肾单层细胞，根据病毒繁殖高峰，取培养的病毒上清液，接种地鼠肾单层细胞，继续传代。病毒滴度在10代前一直较低，病毒繁殖高峰也长达20天左右。到37～43代期间，滴度才上升到104～104.5，繁殖高峰缩短为8~10天。传至44代之后，病毒滴度基本稳定在104.5左右，繁殖高峰也稳定在5~7天。但继续传代至68代，病毒滴度未见上升，繁殖高峰也未见进一步缩短。在整个传代过程均未发现其具有独特的致细胞病变作用，将这一株地鼠肾细胞适应株称为“a”株。 
  第三阶段，为进一步提高“a”株病毒滴度，将第55代的“a”株病毒在豚鼠脑内传代和地鼠肾细胞传代交替进行，练果在交替传三代后，地鼠肾细胞培养液的病毒滴度提高到104.5～105.5或更高，将这株病毒称为“aG”株，用于地鼠肾细胞组织培养疫苗的生产。使用于制造疫苗的毒种为经豚鼠脑内传代，将豚鼠脑毒种用60%的甘油缓



  


冲盐水于-10℃以下保存，脑毒种的病毒滴度在108以上。“aG”株毒种的生物学特性和稳定性经与北京株固定毒进行过此较，结果表明“aG”株对小白鼠、豚鼠、家兔、狗、猴外周神经的致病性几乎完全丧失，中枢神经的致病性明显下降，毒种抗原性经与北京株的交叉保护力和交叉中和试验表明两者的抗原性很相似，没有明显差异。 
四、传代细胞狂犬病疫苗是如何生产出来的   
生物技术的进步，如传代细胞可在微载体上悬浮培养，短时间内可以繁殖大量细胞并可进行工业化的大罐培养，使狂犬病疫苗的生产有达到工业化的规模并降低成本的可能。感染后培养的病毒液可以多次收获，病毒滴度可达106.6TCID50/ml以上，经超滤浓缩、蔗糖-密度离心纯化、β-丙内酯灭活制成冻干疫苗，生产用细胞株和疫苗均经过严格的安全性检查，疫苗中的残留细胞DNA要求＜100pg/剂。 
  佐剂疫苗和非佐剂疫苗的差别是什么？ 
  答：疫苗生产过程中，在收获的病毒培养液上清加入福尔马林灭活，再加硫柳汞防腐剂制成的疫苗称原制疫苗；佐剂是指于抗原混合注入机体后能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。原制疫苗内加入AL(OH)3(0.5mg/ml) 即成为佐剂疫苗，佐剂疫苗的效力与原制疫苗相比效价增加5~60倍不等。现有文献报导加佐剂的狂犬病疫苗虽然有提高免疫力的作用，但由于疫苗的作用缓慢，产生的中和抗体较迟；而狂犬病疫苗主要用于暴露后免疫，要求疫苗快速诱生中和抗体以发挥中和抑制病毒达到保护的作用。因此无



  


佐剂疫苗更加符合狂犬病防治的需要。该试验用无佐剂苗和佐剂苗各一批进行过疫苗人体副反应性和免疫性观察比较，两种疫苗的副反应均很轻，在局部副反应上无佐剂纯化苗略低于佐剂纯化苗；而两种疫苗的抗体应答比较显示无佐剂苗免疫后14天100%抗体阳转，而佐剂疫苗在14天时只有60%阳转。 
  浓缩苗和纯化苗的差别是什么？ 
  答：浓缩苗是原制疫苗经过超滤浓缩制成的，原制疫苗经过浓缩，效力提高5~25倍。但是由于未经纯化疫苗含有一定的杂蛋白，大面积接种后容易出现副反应。纯化疫苗是对病毒培养液进行浓缩纯化。其特点是疫苗内杂蛋白含量较原3~5倍浓缩苗降低98%以上。37℃热稳定试验至少在两周内效价保持稳定，豚鼠过敏试验未发生阳性反应。

毒手药王邓智先

人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞） 
Renyong Kuangquanbing Yimiao(Dishushen Xibao) Rabies    Vaccine  For  Human  Use   (PHK Cell)  
 
本品系用狂犬病病毒固定毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。 
1 基本要求   
生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。 
2 制造 
2.1生产用细胞 生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。 2.1.1细胞管理及检定 
应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.2细胞制备 
选用12~14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养。来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。 
2.2毒种 2.2.1名称 
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。 
2.2.2种子批的建立 
应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。 
原始种子批为2aG1，主种子批应不超过4aG。毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批，在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代，即不超过10aG；在豚鼠脑内传代应不超过第5代，即10aG5。 
2.2.3种子批的检定 
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。 
2.2.3.1鉴别试验 
用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释， 取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合， 同时设立正常血清对照组， 试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只， 每只脑内接种0.03ml， 观察14天，中和指数应不低于500。 
2.2.3.2病毒滴定 
取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml， 观察14天，病毒滴度应不低于8.0 LgLD50/ml。 
2.2.3.3无菌检查 


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依法检查（附录XII A），应符合规定。 2.2.3.4支原体检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 2.2.3.5病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.2.3.6免疫原性检查 
用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml。7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击， 每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。 
2.2.4毒种保存 
冻干毒种应置-60℃以下保存。 2.3原液 
2.3.1细胞制备 同2.1.2项。 2.3.2培养液 
培养液为含适量灭能新生牛血清的乳蛋白水解物、MEM、199或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合规定（附录XIII D）。 
2.3.3对照细胞外源因子检查 依法检查（附录XII C ），应符合规定。 2.3.4病毒接种和培养 
当细胞培养成致密单层后，毒种按0.01－0.1 MOI接种（同一工作种子批应按同一MOI接种），置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35℃继续培养适当时间。 
2.3.5病毒收获 
经培养适宜时间收获病毒液，即为病毒单次收获液。根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获。同一细胞批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液； 
2．3．6 单次病毒收获液检定 按3.1 项进行。 
2．3．7 单次病毒收获液保存 于2-8°C保存不超过30天。 2．3．8 病毒灭活 
病毒收获液中按1：4000的比例加入甲醛溶液（应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活），置适宜温度、在一定时间内灭活病毒。病毒灭活到期后， 每个灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。 
2.3.9合并及超滤、浓缩 
同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围。 
2.3.10 纯化 
经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化。 纯化后可加入适



  


量人血白蛋白作为稳定剂， 即为原液。 
2．3．11原液检定 按3.2项进行。 2.4 半成品 2.4.1 配制 
用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量及抗原量进行配制，总蛋白质含量应不高于80μg/剂，并加入适宜浓度的稳定剂和一定量的硫柳汞作为防腐剂，即为半成品。  
2．4.２ 半成品检定 按3.3项进行。 2．5 成品 2.5．1分批 
应符合“生物制品分批规程”规定。 2.5．2分装 
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.5．3规格 
每瓶1.0ml。每1次人用剂量为1.0ml，狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。 2.5．4包装 
应符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定 
3.1单次病毒收获液的检定 3.1.1病毒滴定 
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.5 LgLD50/ml。 3.1.2无菌检查 
依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.1.3支原体检查 
依法检查（附录XII B）,应符合规定。 3.2原液检定 3.2.1无菌检查 
依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.2.2病毒灭活验证试验 
取病毒灭活后供试品经透析后， 接种25ml于原代地鼠肾细胞或其他适宜敏感细胞， 每3cm2单层细胞接种1ml供试品 ，37℃吸附60分钟后加入细胞培养液，与供试品量比例不超过1：3， 每7天传1代， 将培养21天后的培养液混合取样，分别进行动物法和酶联免疫法检测。 动物法为脑内接种体重为11-13g小鼠20只，每只0.03ml， 观察14天，应全部健存（3天内死亡的不计， 动物死亡数量应不超过试验动物总数的20%）；采用酶联免疫法检查，应为阴性。 
3.2.3蛋白质含量 
取纯化后未加稳定剂的供试品，依法测定，应不高于80μg／剂（附录VI B第二法）。 



  


3.2.4抗原含量 
采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。 3.３半成品检定 无菌检查 
依法检查（附录XII A）,应符合规定。 3.４成品检定 3.４.1鉴别试验 
采用ELISA法检查， 应证明含有狂犬病病毒抗原。 3.４.2外观 
应为无色澄明液体，无异物。 3．4．3 装量 
按附录I A装量项进行， 应不低于标示量。 3.４.4化学检定 3.４.4．1 pH值 
应为7.2-8.0（附录V A）。 3.４.4．2 硫柳汞含量 
应不高于50ug/ml(附录VII B)。 3.４.4．3 游离甲醛含量 
应不高于100ug/ml(附录VI L)。 3.4.4．4 牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（附录VIII F）。 3.4.4．5 地鼠肾细胞蛋白残留量测定 
采用酶联免疫法，应不高于24ug/ml， 并不得超过总蛋白质含量的30%。 3.４.5 效价测定 
应不低于2.5IU/剂（附录XI A）。 3.４.6热稳定性试验 
疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37℃放置14天后，按3.４.5项进行效价测定。如合格，视为效价测定合格。 
3.４.6无菌检查 
依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.４.7异常毒性检查 依法检查（附录XII F），应符合规定。 3.４.8 细菌内毒素检查  
应不高于50EU/剂（附录XII E 凝胶限量试验）。 3.4.11 抗生素残留量检查 
细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查， 采用酶联免疫法， 应不高于10ng/ml。 
4 保存、运输及有效期 
于2-8℃避光保存和运输。自生产之日起，有效期为12个月。

毒手药王邓智先

地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗生产流程 
姓名：任菲菲             学号：10910010120            专业：生物工程 狂犬病作为危害人类健康的最古老的疾病之一流行于世界大多数的国家和地区。据统计，每年都有不少于4000 人死于狂犬病发作。狂犬病疫苗作为对抗狂犬病的唯一有效方法也随之经历了漫长的发展过程。目前世界上存在很多狂犬病疫苗的生产技术，本文讲述的是应用细胞毒株制备狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗。将狂犬病CaG株在原代地鼠肾细胞传代适应，用病毒培养液上清作为产生用毒种，结果通过在地鼠肾细胞传10代左右，适应后病毒液度较高。 1 生产流程 
细胞制备
→种子批建立→种子检测→病毒接种和培养→病毒收获→病毒灭活→合并、浓缩、纯化→原液检定→分装及冻干 
2 主要流程简单说明 2.1 细胞制备 
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。 
选用12—14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，分散细胞，接种培养瓶，用适宜的培养液进行培养。来源于同一批地鼠、同一容器消化制备的地鼠肾细胞为一个细胞消化批。源自同一批地鼠、于同一天制备的多个细胞消化批为一个细胞批。 
培养液为含适量灭活小牛血清和乳蛋白水解物的MEM，199或其他培养液。 2.2 种子批的建立 
生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或其他经地鼠细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。原始种子批为2aG1，主种子批应不超过4aG。毒种在地鼠肾原代细胞和豚鼠脑内交替传代制备工作种子批，在地鼠肾原代细胞的传代应不超过第6代，即不超过10aG；在豚鼠脑内传代应不超过第5代，即10aG5。 2.3 种子检测 
用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释， 取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合， 同时设立正常血清对照组， 试验组与对照组的每个稀释度分别接种11-13g小鼠6只， 每只脑内接种0.03ml， 观察14天，中和指数应不低于500。 
取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为11-13g小鼠至少6只，每只脑内接种0.03ml， 观察14天，病毒滴度应不低于8.0 LgLD50/ml。 


  


用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-14g小鼠，每只0.5ml。7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击， 每只0.03ml，每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。 2.4 病毒接种和培养 
    当细胞培养成致密单层后，毒种按0.01－0.1 MOI接种（同一工作种子批应按同一MOI接种），置适宜温度下培养一定时间后，弃去培养液，用无菌PBS或其他适宜洗液冲洗去除牛血清，加入适量维持液，置33-35℃继续适当时培养间。 2.5 病毒收获 
    经培养适宜时间收获病毒液，即为病毒单次收获液。根据细胞生长情况，可换以维持液进行多次病毒收获。同一细胞批的同一次病毒收获液经检定合格后可合并为单次病毒收获液。 2.6 病毒灭活 
    病毒收获液中按1：4000的比例加入甲醛溶液（应在规定的蛋白浓度范围内进行病毒灭活），置适宜温度、在一定时间内灭活病毒。病毒灭活到期后， 每个灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。 2.7 合并、浓缩、纯化 
同一细胞批制备的多个单次病毒收获液检定合格后可合并为一批，经超滤或其他适宜方法浓缩至规定的蛋白质浓度范围。经浓缩后的病毒液采用柱色谱法或其他适宜的方法纯化。 纯化后可加入适量人血白蛋白作为稳定剂， 即为原液。 3 总结 
通过对狂犬病毒aG 株在金黄地鼠肾细胞上传代培养, 获得一种新型狂犬病毒毒株, 即地鼠肾细胞适应株( CaG 株)。由于该毒种具有生产方法简单, 成本低廉, 且外源因子污染机率小等优点, 因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗。在相同条件下, 分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产3 批病毒原液, 经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗。经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好, 疫苗免疫效价与豚鼠脑毒种疫苗无明显差异。

毒手药王邓智先

生物制药工艺与设备 
 I 
狂犬病及其疫苗的研制过程 
  
摘要：目的 应用Vero细胞研制人用精制狂犬病疫苗。方法 应用Vero细胞经转瓶或生物反应器培养制备人用精制狂犬病疫苗。结果 各项质控指标均符合WHO 和中国生物制品规程标准, 经Ⅰ 期临床观察疫苗是安全的。结论 用Vero细胞生产的狂犬病疫苗产量大, 效价高, 不良反应少, 且能进行工业化生产。 
关键词：狂犬病 病毒 疫苗 Vero细胞  
狂犬病是一种自然疫源性疾病, 是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患性疾病, 一旦发病, 100%死亡。唯一有效的预防手段就是及时注射狂犬疫苗。我国每年需要600万人份左右的狂犬病疫苗。但是我国现行的原代地鼠肾细胞培养狂犬病疫苗。生产工艺落后, 生产效率低, 特别是疫苗的稳定性差, 免疫失败的例子很多, 尽管1994 年开始浓缩3～5 倍, 一定程度上解决了疫苗稳定性差的问题, 但浓缩后的副反应比较严重。所以研制和生产国际上已得到广泛承认和推广的Vero细胞疫苗已势在必行。 
狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，所有温血动物包括人类，都可能被感染。它多由染病的动物咬人而得。一般认为口边出白色泡沫的疯狗咬到传染，其实猫，白鼬，浣熊，臭鼬，狐狸或蝙蝠也可能患病并传染。患病的动物经常变得非常野蛮，在唾液里的病毒从咬破的伤口进入下一个病人。狂犬病从一个人传到另外一个人极为少见，患狂犬病的人类患者多数会发病身亡。 
狂犬病病毒对神经系统有强大的亲和力，病毒进入人体后，主要沿神经系统传播和扩散，病毒侵入人体后先在伤口的骨骼肌和神经中繁殖，这称为局部少量繁殖期，此期可长可短，最短为72小时，最长可达数周、数月甚至更长。病毒在局部少量繁殖后即侵入神经末梢，沿周围神经以每小时3mm的速度向中枢神经推进，到达脊髓后即大量繁殖，24小时后遍布整个神经系统。以后病毒又沿周围神经向末梢传播，最后到达许多组织器官，如唾液腺、味蕾、角膜、肌肉、皮肤等，由于头、面、颈、手等部位神经比较丰富，病毒易于繁殖，再加上离中枢神经较近，故这些部位被咬伤后发病者较多，潜伏期也较短；伤势越严重，也越容易发病。病毒在中枢神经中主要侵犯迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核等。这些神经核主要支配吞咽肌和呼吸肌，受到狂犬病病毒侵犯后，就处于高度兴奋状态，当饮水时，听到流水声，受到音响、吹风和亮光等刺激时，即可使吞咽肌和呼吸肌发生痉挛，引起吞咽和呼吸困难。 
导致狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒（Rabies Virus）。完整的狂犬病病毒呈子弹形，长度大约为200纳米左右直径为70纳米左右。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。目前普遍认为狂犬 
狂犬病说明及防治病病毒有四个不同的血清型。狂犬病病毒对不利环境的抵抗力非常弱，在表面活性剂、消毒剂如甲醛、升汞、碘酒还有酸碱环境下会很快失去活性，并且对热和紫外线极其敏感。 
人用狂犬病疫苗既往种类较多，现今国内外多使用细胞培养疫苗。我国现在使用的有精制VERO细胞狂犬病疫苗和精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗，浓缩地鼠肾细胞狂犬病疫苗已禁用。     狂犬病疫苗人用精制VERO细胞狂犬病疫苗及精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗均为轻度混浊白色液体，久放形成可摇散的沉淀，含硫柳汞防腐剂。 
1材料和方法 
1.1细胞及其培养 


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生物制药工艺与设备 
 II 
Vero 细胞株: 来源于中国药品生物制品检定所, 并进行了细胞的外源因子检查、肿瘤原性检查、染色体检查, 证明该细胞无细菌、霉菌、支原体及病毒污染, 无致肿瘤性, 细胞染色体分布在58～60 之间, 符合世界卫生组织狂犬病专家委员会制定的关于应用传代细胞制备疫苗的规程要求。 1.2狂犬病病毒 
狂犬病毒固定毒CTN-1珠，由中国药品生物制品检验所提供。毒种毒力≥7.5LD50/ML,小白鼠脑内法作中和试验，中和指数大于500，无菌试验及病毒外源因子检查阴性，符合WHO提出的疫苗生产用毒种要求，并经WHO狂犬病专家委员第七次会议确定，可用于狂犬病疫苗的生产。 
1.3病毒滴定及效力试验 
按1995年版《中国生物制品规程》进行。 1.4蛋白质含量测定 
采用Lowery法。 1.5残余牛血清含量测定 
采用反向间接血凝抑制剂实验，所用试剂均为中国药品生物制品鉴定所提供。 1.6Vero细胞残余DNA检测 
采用Dig标记点样杂交法。 1.7FPLC 
购自Amersham&#160hamacia Biotech。 1.8超滤器 
购自Millipore Co.。 1.9微载体及生物反应器 
Cytodex1和Cytodex3购自Amersham&#160hamacia Biotech；5、15和50L搅拌式生物反应器购自B.Braun Biotech Intermationl。 1.10原苗制备 
将Vero 细胞复苏后, 按常规传代到中方瓶中, 经连续5～6次传代分种, 得到足够多的细胞, 再用12～14 个中方瓶转种到一个10L 转瓶中, 使整个转瓶表面形成单层, 转瓶培养长成单层后, 细胞经胰酶和EDTA 消化, 加入CT N-1 液体毒种, 充分吸收后, 继续在转瓶中培养, 37℃, 72h 后洗换掉生长液, 加入维持液, 以后每隔72～96h 收获, 可连续收4～5 次。生长液为含8%小牛血清的Hanks 液, 维持液不含小牛血清, 但含人白蛋白Hanks 液。将收获的原液合并, 抽样做毒力、无菌、蛋白含量测定。 1.11下游工艺 
用0. 45m 滤膜澄清原苗, 截留分子量为10 万的超滤膜超滤浓缩, 再经离心和柱层析纯化, 加入-丙内酯灭活剂, 补加人白蛋白及佐剂, 调pH 至7. 2～ 7. 8, 测定DNA 残留量及灭活效果, 进行分装及成品检定。 1.12检定方法 
效力、牛血清蛋白残留量、无菌试验、蛋白含量、毒性试验、理化试验均按文献, 细胞DNA 残留量测定, 按文献。 1.13I期临床观察方案 
20名健康志愿者按0、3、7、14、28d在上臂三角肌肌肉内注射1.0ml疫苗。观察局部反应和全身反应。 
2结果与分析 
2.1Vero细胞库的建立 
将Vero 细胞种子扩增传代, 制备种子细胞库和生产细胞库, 冻存于液氮中。细胞库经



  


生物制药工艺与设备 
 III 
细菌、霉菌、支原体及外源因子检查均为阴性。用裸鼠进行致癌性检查, 阳性对照(Hela细胞)10/10 发生肿瘤,Vero细胞（0/10）无肿瘤发生。染色体检查证明细胞核学稳定, 计数100 个中期细胞, 其染色体分布高峰数目为56~58 条, 符合WHO关于“ 动物细胞体外培养生产生物制品规程” 的要求。 2.2CTN-1V株毒种库的建立 
将25代CTN-1V珠Vero细胞上传代, 建立基础毒种库（CTN-1V28）,CTN-1V33代为生产毒种库, 冻存于一70℃ 冰箱, 并经细菌、霉菌、外源因子、支原体检查均为阴性。毒力基本上稳定在7.0Log-LD50/ML以上。 2.3疫苗的制备 
采用100ML方瓶→2L 方瓶→ 10L转瓶或5L→15L→50L 生物反应器扩增培养Vero 细胞, 待3~5d细胞长成单层可接种毒种, 并用0.05、0.01和0.002MOL进行试验, 种毒后3天开始收毒, 每隔2天收获一次病毒液, 结果表明病毒感染量不同, 病毒滴度（3次平均值）也不同。  
2.4疫苗的浓缩、灭活和纯化 
将原苗合并后澄清, 经超滤浓缩30 一50倍, 用1/4000的丙内醋灭活病毒, 用硫酸鱼精蛋白去除Vero细胞DNA进行初步纯化, 再经一步柱层析法提纯抗原。收集I峰合并, 加人人血白蛋白和Al(OH)3, 分装即成精制Vero细胞狂犬病疫苗。 2.5疫苗的检定 
用上述工艺生产的3 批Vero细胞狂犬病疫苗,经自检和中国生物制品检定所检定, 疫苗质量均符合WHO规程和《中国生物制品规程》的要求。 2.6期临床观察 
1999 年4 月获准I期临床观察, 接种20 名志愿者。5 针全程免疫后, 未发现全身不良反应, 局部反应极轻微, 极少数接种者注射部位出现疼痛, 但注射后1 一2 d 疼痛消失, 此疫苗是安全的。 
3结论与讨论 
用Vero细胞生产狂犬病疫苗产量大, 效价高，不良反应小, 且能进行工业化生产。目前法国巴斯德研究所生产的维尔博狂犬病疫苗就是一种Vero细胞狂犬病疫苗, 其毒株为PM。 
国内用Vero细胞作为基质研制的狂犬疫苗和乙型脑炎疫苗都采用了二步柱层析法步骤较为复杂。本研究先用硫酸鱼精蛋白除去VerO 细胞DNA , 再用Sepharose4FF 一步柱层析法纯化Vero 细胞狂犬病疫苗, 操作简单, 生产的疫苗质量符合W H O规程和( 中国生物制品规程) 的要求。经I期临床观察证明此疫苗是安全的, 需进行2-3 期临床观察, 进一步评价该疫苗的安全性和免疫效果。 参考文献 
[1]黄仕和,桑爱军,乐威等.人用精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制.武汉生物制品研究所 [2]窦志勇,李春英,钱 浩等.人用纯化Vero 细胞狂犬病疫苗的研制.辽宁省卫生防疫站 [3]于伟,刘兆文,钱浩等.精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察

resuper114

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半拉木匠

“014年各行业工程师考试备考资料及真题集锦  安全工程师  电气工程师  物业管理师  注册资产评估师  注册化工工程师  ”
@yuansoul

yuansoul

半拉木匠 发表于 2014-8-20 16:45
“014年各行业工程师考试备考资料及真题集锦  安全工程师  电气工程师  物业管理师  注册资产评估师  注册化 ...

很久没有想法去考试了。

syhorchid

谢谢分享

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搬运工作不到位啊！