帮忙看下这份内毒素方法验证的内容，首次做心里没底。

bax193532

1.      接受标准

表8-1接受标准
项目	接受标准
LAL	每1mg拉氧头孢中含内毒素的量应小于0.05EU

2.      方法描述

2.1.     方法步骤：确定最小有效稀释浓度C、干扰试验预试验、干扰试验。

2.2.       供试品最小有效稀释浓度C的确定

2.2.1.    供试品最小有效稀释浓度C=λ/L。式中—检品的细菌内毒素限值（EU/ mg）；λ—鲎试剂标示灵敏度（EU/ mL）。

2.2.2.    本次试验选用鲎试剂灵敏度为0.125EU/mL。C=λ/L=0.125 EU/mL /0.05 EU/mg =2.5mg/ml。则BT01酸细菌内毒素检查预试验稀释浓度为：20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml。

2.2.3.     细菌内毒素工作标准品的制备：取工作标准品1支，加BET水1mL，混漩15分钟，得80EU/mL细菌内毒素标准溶液。用BET水稀释：8EU/mL=4.5mL BET水 + 0.5mL 80EU/ mL。同上操作将8EU/ mL的标准溶液稀释至2λ(0.25EU/ mL)、1λ(0.125EU/ mL)、0.5λ(0.06EU/ mL)、0.25λ(0.03EU/ mL)等标准系列溶液。

2.3.       干扰试验预试验：

2.3.1.    供试品稀释液的制备，40mg/ ml供试品溶液：取BT01酸248mg加BET水5ml得到混漩溶解，即得。（根据BT01酸水分最大3%，含量最小83%折算得出应取样品248mg。）

2.3.2.    供试液溶液稀释

20mg/ mL供试品溶液：40mg/ ml供试品溶液2mL +2mL  BET水

10mg/ mL供试品溶液：20mg/ ml供试品溶液2mL +2mL  BET水

5mg/ mL供试品溶液：10mg/ ml供试品溶液2mL +2mL  BET水

2.5mg/ mL供试品溶液：5mg/ ml供试品溶液2mL +2mL  BET水

2.3.3.    供试液阳性对照溶液稀释

20mg/ mL供试品溶液2λ：40mg/ ml供试品溶液2mL +2mL0.5EU/ mL内毒素标准品

10mg/ mL供试品溶液2λ：20mg/ ml供试品溶液2mL +2mL0.5EU/ mL内毒素标准品

5mg/ mL供试品溶液2λ：10mg/ ml供试品溶液2mL +2mL0.5EU/ mL内毒素标准品

2.5mg/ mL供试品溶液2λ：5mg/ ml供试品溶液2mL +2mL0.5EU/ mL内毒素标准品

2.3.4.    准备鲎试剂：取规格为0.1ml/支的鲎试剂20支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕后加入0.1mlBET水溶解，8支加入供试品10.3.2；8支加入供试品阳性10.3.3；2支加入0.1ml2λ的内毒素标准品溶液作为阳性对照,；2支加入0.1mlBET水作为阴性对照。

2.3.5.    干扰试验预试验结果

表一

样品批号

鲎试剂批号

项目

样品浓度mg/ml

阴性对照

阳性对照

20

10

5

2.5

供试品

供试品阳性阳性

供试品

供试品阳性阳性

2.3.6.     预试验结论：当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性，试验有效；且供试品管阴性，阳性对照管为阳性，认为供试品在该浓度下不干扰试验。由表一可见，当样品稀释至______浓度时对2个批号鲎试剂均不存在干扰作用。

2.4.       干扰试验

2.4.1.    根据干扰预试验结果，取3个批号的供试品，用BET水稀释成浓度为____的溶液，以该溶液和BET水分别将内毒素工作标准品稀释成0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml、0.03125EU/ml的溶液。然后用灵敏度为0.125EU/ml的2个批号的鲎试剂按2010版中国药典（二部）细菌内毒素检查法规定进行正式干扰试验，试验结果见表二、表三。

2.4.2.    干扰试验结果

表二

鲎试剂批号

样品批号

细菌内毒素浓度EU/ml

供试品2.5mg/ml

Et

0.5（2λ）

0.25（1λ）

0.125（0.5λ）

0.0625（0.25λ）

内毒素标准品溶液

Es

阴性对照

结论

合格□             不合格□

表三

鲎试剂批号

样品批号

细菌内毒素浓度EU/ml

供试品2.5mg/ml

Et

0.25（2λ）

0.125（1λ）

0.0625（0.5λ）

0.03125（0.25λ）

内毒素标准品溶液

Es

阴性对照

结论

合格□             不合格□

2.4.3.    由表二、表三可见，将各批号的供试品原溶液稀释至_____mg/ml时，选用0.125EU/ml的2个批号的鲎试剂进行干扰，阴性对照均为阴性，Es为0.5~2.0λ，Et为0.5~2.0Es。表明该浓度下的供试品对鲎试剂与内毒素的反应无干扰作用，故可以采用内毒素凝胶法进行质量控制。

linlinhuan

好还缺常规做法

lov_new

这个试验设计的相当不错，有个干扰试验预实验就可以避免药典里面B组需要那么多试验数了，赞一个！

lov_new

1、表二、表三的内毒素浓度为何不一样？
2、表二、表三“供试品2.5mg/ml"是什么作用？为什么不是其他浓度？
3、供试液阳性对照溶液稀释后尚有4分之一的水，能否符合药典要求？

bax193532

lov_new 发表于 2015-9-22 21:52
1、表二、表三的内毒素浓度为何不一样？
2、表二、表三“供试品2.5mg/ml"是什么作用？为什么不是其他浓度 ...

1、表二、表三的内毒素浓度为何不一样？
是我理解错了，2个厂家相同灵敏度的鲎试剂
2、表二、表三“供试品2.5mg/ml"是什么作用？为什么不是其他浓度？
2.5mg/ml是这产品的最小有效浓度，是以后日常测试供试品的浓度
3、供试液阳性对照溶液稀释后尚有4分之一的水，能否符合药典要求？
阳性对照目的证明试验条件浓度下鲎试剂灵敏度符合要求，跟着供试品走，药品标准操作规范上有阳性对照溶液配制事例的

lov_new

发现个问题：你这个内毒素检查预试验稀释浓度为最小的应该是0.6mg/mL.

bax193532

lov_new 发表于 2015-9-23 23:35
发现个问题：你这个内毒素检查预试验稀释浓度为最小的应该是0.6mg/mL.

怎么出来的0.6mg/ml？
MVC=λ/L=0.125 EU/mL /0.05 EU/mg =2.5mg/ml

lov_new

MVC=λ/L=0.03EU/mL /0.05 EU/mg =0.6mg/ml
计算方法可以参考药品标准操作规范。

bax193532

lov_new 发表于 2015-9-24 18:45
MVC=λ/L=0.03EU/mL /0.05 EU/mg =0.6mg/ml
计算方法可以参考药品标准操作规范。

我写了灵敏度0.125，你给我改0.03？

lov_new

bax193532 发表于 2015-9-25 11:06
我写了灵敏度0.125，你给我改0.03？

你去看看操作规范，就知道我为什么改为0.03了。

bax193532

lov_new 发表于 2015-9-25 13:23
你去看看操作规范，就知道我为什么改为0.03了。

标准上说的避免造成假阳性建议使用较低灵敏度的鲎试剂
我这边的是原料药，产品限制0.05eu/mg，测试浓度是2.5mg，不是1mg，是通过计算最小有效浓度下内毒素限制再转换到eu/mg的

bax193532

bax193532 发表于 2015-9-25 15:43
标准上说的避免造成假阳性建议使用较低灵敏度的鲎试剂
我这边的是原料药，产品限制0.05eu/mg，测试浓度 ...

测试结果是＜0.125eu/2.5mg，再换算成每mg的内毒素含量