单抗ELISA测定EC50

李欣～

各位好，有个问题咨询一下大家。最近在做elisa，选了两个公司的抗原包被，二者包被浓度不同，做出来的ec50也不一样，差很多，所以想问包被抗原对EC50的测定影响很大吗？这到底是什么原因造成的，谢谢大家

我爱山之东

楼主所谓的EC50变异大，大多少？以我个人经验来看，不同天，同一天不同人之间的EC50不具备可比性，不同天试验的EC50差别可能会达到2~3倍之多。抗体药物结合活性给出的都是相对活性，不用关注EC50变异的问题。此外不同厂家的抗原包被浓度不一样是有可能的！
建议在ELISA试验中加入Control组（Reference 单独再稀释一遍加入）中文叫质控组，功能类似于液相的系统适用性。要想EC50数值稳定一下，首先方法开发时候要科学完整，其次要使用风险评估的方法控制关键步骤，关键物料！建议多看看USP 1032 1033 1034 USP1220。

山顶洞人

不懂什么叫包被！等楼下！

章丘小孩

不懂你做的是什么？！

李欣～

山顶洞人 发表于 2018-10-18 19:48
不懂什么叫包被！等楼下！

就是第一步，抗原和固相载体结合

李欣～

章丘小孩 发表于 2018-10-18 19:50
不懂你做的是什么？！

elisa测单抗的ec50.第一步抗原和固相载体结合，我们选择了不同公司生产的抗原，得到的最佳包被浓度不同，最后的EC50测出来差距很大，差十个数量级。所以想问是什么造成这种现象的，是同种抗原，只不过不同公司生产的而已

lingshike

建议在医疗器械板块发帖，或者版主移过去。这里做药的多，但是做生物免疫的，估计较少。

李欣～

Doitasyoulike 发表于 2018-10-19 16:12
不懂的就别回答了，害的楼主空欢喜
建议去某园的分析技术板块去咨询

好滴，感谢回复

李欣～

lingshike 发表于 2018-10-19 13:51
建议在医疗器械板块发帖，或者版主移过去。这里做药的多，但是做生物免疫的，估计较少。

按你说的做了，然后被删帖了，原来这个论坛有管理员呀

临渊求药James

两个公司的抗原是否都是单抗？即是是同种抗原，由于不同公司生产工艺差别，抗原活性可能会有比较大差别。另外，正常来说，两个公司抗原包板后，应该相差一两个数量级，而你说的十个数量级，可能是有问题的。这需要一步一步排查

李欣～

hjylmj@126.com 发表于 2018-10-20 17:55
两个公司的抗原是否都是单抗？即是是同种抗原，由于不同公司生产工艺差别，抗原活性可能会有比较大差别。另 ...

谢谢您的回答。都是PD-L1的抗原，最终结果我表述错了，哈哈哈，是十倍，不是十个数量级。。EC50一个大概40，一个3.5。还想问下您应该怎么排查呢，实验具体步骤着手吗

李欣～

我爱山之东 发表于 2018-10-21 13:50
楼主所谓的EC50变异大，大多少？以我个人经验来看，不同天，同一天不同人之间的EC50不具备可比性，不同天试 ...

嗯好的，谢谢您的建议。EC50大概差十倍，最佳包被浓度一个10一个20。感谢感谢

我爱山之东

李欣～ 发表于 2018-10-22 09:11
嗯好的，谢谢您的建议。EC50大概差十倍，最佳包被浓度一个10一个20。感谢感谢

建议看看方法开发的时候有没有摸索过抗原包被量，包被条件！还有就是对于抗原的质控做了哪些，够不够？（抗原来源、保存条件、效期、批次之间的桥接实验）

李欣～

我爱山之东 发表于 2018-10-22 15:03
建议看看方法开发的时候有没有摸索过抗原包被量，包被条件！还有就是对于抗原的质控做了哪些，够不够？（ ...

嗯嗯，好的。我们是委托CMO开发的，最初选定了一家公司的抗原，后来又换了一家说上平台明显，EC50小，建议改变抗原供应商。我没做过这方面的实验，所以不知道咋分析，非常感谢您的建议。另外，我想问下您，单抗elisa开发会涉及到不同厂家抗原的选择吗，我看一般不会单独研究这个

cnosema

李欣～ 发表于 2018-10-22 15:35
嗯嗯，好的。我们是委托CMO开发的，最初选定了一家公司的抗原，后来又换了一家说上平台明显，EC50小，建 ...

即便都是单抗，不同公司做出来的单抗，以及同一公司做出来的不同种的单抗，都需要筛选一下

不是所有的单抗，都是一样的哈

我爱山之东

李欣～ 发表于 2018-10-22 15:35
嗯嗯，好的。我们是委托CMO开发的，最初选定了一家公司的抗原，后来又换了一家说上平台明显，EC50小，建 ...

嗷嗷，外委CMO一般都不给方法开发资料。
我们做的话，1.抗原厂商（稳定的大厂商，会挑选两到三家公司抗原于SOP中说明不同厂家包被浓度，抗原是关键物料，选择两家以上为了抵御风险，活性方法变更属于重大变更对应的研究工作比较多，方法开发阶段这么做可以避免进行方法变更研究）；2.抗原包被浓度；3.包被条件（CBS pH值、37℃ or 4℃过夜）；4.封闭条件（BSA or 脱脂奶粉 浓度多少）；5.洗涤条件；6.二抗显色类型（光吸收、化学发光）、厂家、浓度、反应条件；7.显色时间。
方法开发越详细，对于方法的了解程度越高，使用方法开发阶段的数据跟方法确认时候的数据对于方法进行一个初步的风险评估，找到关键试剂及关键物料进行对应的管控。
亲和力的测定方式ELISA属于比较传统的类型，现在的Biacore或者Octet在ELISA基础上可以得到Kon、Koff数值具有更好的效果跟意义。

李欣～

cnosema 发表于 2018-10-22 22:17
即便都是单抗，不同公司做出来的单抗，以及同一公司做出来的不同种的单抗，都需要筛选一下

不是所有的 ...

嗯嗯，了解了。谢谢您的回复

李欣～

我爱山之东 发表于 2018-10-23 08:27
嗷嗷，外委CMO一般都不给方法开发资料。
我们做的话，1.抗原厂商（稳定的大厂商，会挑选两到三家公司抗 ...

嗯嗯，了解了。非常感谢您的回复，学到了很多，感谢感谢

我爱山之东

李欣～ 发表于 2018-10-23 09:03
嗯嗯，了解了。非常感谢您的回复，学到了很多，感谢感谢

相互学习，术业有专攻而已！