浅谈病毒质量与病毒灭活清除工艺验证

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文〡科志康

随着近年来生物药产业的蓬勃发展，有关生物制品病毒安全性的话题也逐渐进入研发和生产人员的视线内。生物制品由于起始原材料来源于微生物或人/动物源的细胞、组织和体液，其制备过程或制剂中可能添加人或者动物来源的原辅材料，具有潜在的受病毒污染的风险，因此国内外均对其病毒安全性提出了明确的法规要求。

中国自2002年起先后制订颁布了多个有关生物制品、血液制品、生化药品病毒灭活/清除的法规文件，用予规范指导上述产品的病毒灭活/清除工艺的建立及验证、审评。其中《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》二项法规尤为重要和基础，在国内执行至今已十年有余，一直被后续法规参考遵循。2017年药品生产质量管理规范（2010年修订）生化药品附录颁布。2020年版中国药典三部新增了生物制品病毒安全性控制章节。2020年7月10日以后开始的药学研究的病毒安全性研究部分，也已适用ICHQ5A评价指导原则。自此，国内对于生物制品病毒灭活/清除的法规要求与国际通行的要求基本一致。

在病毒灭活清除工艺验证试验中，我们通常选择人为加入一些指示病毒（VirusSpike）去评估工艺的有效程度。可是，这些病毒液加入后多多少少改变了接受验证的料液的原始性质，例如杂质情况、蛋白水平等等，导致验证的结果未必能反映真实情况，从而影响到我们最终去评估病毒下降量LRV，以及随之带来的成本考量。因此我们需要尽可能的提高病毒的质量，降低他们对料液的影响。总的来说，病毒的质量可以从几个角度去衡量，包括病毒的滴度、病毒纯度和杂质情况、病毒与天然病毒的相似程度以及病毒对理化因素的抵抗程度等，他们都会对验证试验的结果产生直接的影响。

病毒的滴度：高滴度的指示病毒能带给病毒清除灭活工艺验证试验更高的病毒挑战量，从而可能达到更高的病毒下降量LRV，带给产品更好的产品安全性保证。同时，病毒滴度提高也意味着只需要加入更少量的病毒，就可以达到法规要求的病毒挑战量，在一定程度上减少了杂质的带入，也有利于产品料液对于除病毒膜和填料的通过性。但是滴度越高，病毒颗粒倾向于聚集，也会带来一定的负面影响。

病毒与天然病毒的相似性：人为培养的高滴度病毒可能与天然的病毒存在形式有一定的差异，比如容易形成病毒颗粒的聚集，从而高估工艺步骤病毒清除能力。因此需要采用一些预处理方法（比如过滤或者超声）避免或处理掉病毒聚集，才能比较准确的评估评估工艺的真实灭活清除能力。

病毒的纯度和杂质情况：病毒液中的杂质情况也很重要。通常病毒液中杂质来源于：一是病毒生产工艺产生的杂质，如培养细胞的残留（宿主细胞的碎片\DNA\蛋白质等等），二是病毒本身的一些碎片、空的外壳等等。这些杂质会严重影响料液通过除病毒膜，也会影响层析填料的载量。因此一般会通过一些病毒纯化步骤，去除这些杂质，降低对验证试验的影响。例如，在DavidJ. Roush等于2015年发表的一项研究结果中，研究者比较了多批次采用不同纯化工艺制备的小鼠白血病病毒（x-mulv）的质量水平及在除病毒过滤中的表现，结果发现采用层析工艺纯化的病毒具有更低的杂质含量，更高的滴度水平。在纳滤试验中，纯化水平更高的病毒能大幅度提升料液通过除病毒膜的通量，20%~163%不等。

病毒对理化因素的抵抗程度：通常我们应该选择对理化抗性强的病毒种类或者病毒毒株来进行病毒灭活清除的工艺验证。例如在验证低pH工艺的时候，VSV由于其对酸性条件较高的耐受，成为一种很好的指示病毒选择，可以用来考验工艺灭活能力的强固程度。

在综合考虑这些因素后，采用高滴度、高纯度、与天然病毒更接近的存在形式的指示病毒应用于病毒灭活清除工艺验证试验，不仅能够使得验证人员获得更为真实的病毒下降量LRV；也有利于产品本身获得更好的经济效益(除病毒膜的耗费、填料的损耗等)。

参考文献：

1 生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则【S】GPH3-1. 2005

2 血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则国药监注【2002】160号

3 多组分生化药注射剂基本技术要求（试行）国食药监注【2008】7号

4 药品生产质量管理规范（2010年修订）生化药品附录 2017年第29号

5 《中国药典》2020版 三部 生物制品病毒安全性控制

6 VIRAL SAFETY EVALUATION OF BIOTECHNOLOGY PRODUCTS DERIVED FROM CELL LINES OF HUMAN OR ANIMAL ORIGIN ICH Q5A(R1)

7David J. Roush，Adam Myrold，Michael S.Burnham.Limits in Virus Filtration Capability? Impact of Virus Quality and Spike Level on Virus Removal with Xenotropic Murine Leukemia Virus.Biotechnology Progress 2015,135-144.

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