15种蛋白质单晶培养的方法

大道至简12345

（1）大量养晶法（bulk crystallization）：若急着养出单晶，则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液，直到溶液中出现乳白混浊色，离心后把上清液（suppernatant）放置数天至数周，有可能养出单晶。

（2）批次养晶法（batch method）:若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药品，在浓度C1产生沉淀，浓度Cn为液体，则在C1至Cn之间细分成一串浓度 C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）个小试管进行养晶，可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。

（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白质溶液包在半透膜（membrane）内，浸入盛有化学药品的器皿中，半透膜能让小分子进出，却不会让蛋白质等大分子通过，则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜，与蛋白质起作用，直到膜之内外的浓度梯度（concentration gradient）降到零为止。此法的好处在于，器皿中化学药品之浓度可作连续之调整，pH值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时，平衡速率也随之降低。



（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的体积缩小，绑在比钮扣略大的衬架上，架体之凹槽内注入蛋白质溶液，包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的器皿，其养晶原理与大量透析法相同，只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不得留有气泡，否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡，渗入膜内的蛋白质溶液。

（5）连续萃取（sequential extraction）：此法所根据的原理是亚可比（Jacoby）的实验，他发现蛋白质在硫酸铵溶液中溶解度随温度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵液体，使蛋白质溶液沉淀，离心除去上清液。接着保持4℃以下处理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂（通常为蒸馏水），浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物中，以玻棒搅拌并离心，取出上清液，放在室温养晶，再把浓度次高的沉淀剂加入上次未完全溶解的蛋白质沉淀物，搅拌离心，把上清液置于室温养晶，依次类推，直到蛋白质全部溶解为止。这样每次取出的蛋白质浓度依次递减，溶液由低温移至高温，符合亚可比的准则，可能养出蛋白质单晶。



（6）自由接口间的扩散法（free interface diffusion）：若蛋白质在不同的溶剂中具有不同的溶解度，则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出，装置如图7-10所示。

（7）凹盘或玻片上的蒸汽扩散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液，同时添加的化学药物与蛋白质起作用，协助晶核的形成。掺有化学药品的蛋白质溶液，其水分慢慢扩散，达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气中，水分蒸发掉，则蛋白质干涸，无法形成单晶，原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构，含有大量水分，水分与蛋白质间形成许多氢键，水分蒸发，蛋白质也无以为系，因此必须保持水分，使蛋白质溶液密闭在一个容器中。同时还得调节水分，所以必须置放两种溶液，使蛋白质溶液中的水分扩散到另一种高浓度的溶液中，以达蛋白质溶液的过饱和。通常选择适当的盐类和有机溶剂，调在等电点的pH值，形成沉淀剂，把粉晶蛋白质泡成一定浓度，约在5～40mg/ml之间，在凹盘的下凹孔镀硅，注入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共10～40 m l。在凹盘外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉淀剂。在塑料的四周涂真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常这样的塑料盒对于每种养晶条件制备两盒，一盒放在4℃的低温，另盒放在室温，待其长晶，快则一周，慢则数月，幸运的话，可望长出单晶。通常一次制备数拾条件，大量养晶。要鉴定长出的单晶确实是蛋白质而不是滴入的沉淀剂等化学药品。若养出蛋白质单晶太小，不足以供X光绕射实验使用，则可使用连续播种法把小晶粒养大：依照养出蛋白质小单晶的条件，炮制母液（蛋白质溶液配合沉淀剂），注入凹孔，外围倒注沉淀剂，加以密封，等待约半天后，打开封盖，把以前所养的小晶粒稍加清洗后放入，企图长大，若长出的晶体仍然不符X光使用，则把最后一次的晶体当新晶种，再继续播种，直到晶体够大。此种养晶法的好处是：用量少，筛选多种条件相当理想;易于修饰塑料盒内沉淀剂的浓度。此种养晶法装置，也可用具有凹槽的玻片来取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉淀剂，以小玻片密封，等待长晶。



（8）悬滴液蒸汽扩散法（vapor diffusion in hanging drops）—悬滴法: 它在原理上和座滴法相同，皆以蒸汽达到平衡，利用少量蛋白质筛选多种养晶条件。此法用量比座滴液更少。在方形或圆形的玻片上镀硅，滴入少于10m l的蛋白质母液，在培养皿的每一凹槽中注入1 ml的沉淀剂，把方形玻片翻转，盖在凹槽孔缘，加以密封，形成悬滴液，进行扩散，蛋白质溶液达到过饱和，长出单晶。

（9）液体桥连法（liquid bridge）如图7-12(b)所示，一小滴母液和一滴沉淀液分别滴在玻璃片的两靠近处，以细针引导细桥相接，把此载有液滴的玻片放在密封容器中，在细桥相连处可望长出单晶。

（10）浓度透析法（concentration dialysis）：，离子强度弱，则蛋白质溶解度低，易形成晶核，长出单晶，可利用氮气在装有蛋白质和盐类的透析袋内施压，使盐类穿透透析膜流出，降低袋内盐类浓度，使蛋白质溶液在低离子强度下长出单晶。

（11）pH引导长晶法(crystallization induced by pH)：蛋白质的溶解度在等电点的pH值最低，是个良好的养晶条件。有些蛋白质在不同的数个pH值，具有数个溶解度的极小，这些溶解度极小处可望长晶。利用透析法改变透析膜外的pH值是个好办法。也可在蒸汽扩散法中，在外围滴入挥发性酸或碱（如氨水或干冰等）来调节pH值。

（12）温度长晶法（temperature crystallization）：蛋白质溶解度为温度的函数，有些溶解度非常温度敏感。通常温度降低，分子排列较有秩序，引起能趋疲（熵）（entropy）的降低。由液体转变到固体，其熵会降低，反之亦然。井然有序排列的分子易于长晶。通常一种长晶条件泡两份，一份置于室温，另一份放在 4℃的冰箱。

（13）蒸发（evaporation）：这是最原始的方法，为小分子的长晶常用法，也是某些蛋白质常用的养晶法。在蛋白质不变性的条件下，慢慢让母液蒸发，使蛋白质溶液达到过饱和，结出单晶。

（14）填加有效分子法（effector addition）：与有效分子（effector）结合的蛋白质，其溶解度往往与无有效分子结合者差异大，可达到某些构象（conformation）平衡状态的存在，养出此种构象单晶，通常的有效分子有配位体（ligand）和基质(substrate)等。

（15）对蒸馏水透析法（dialysis against water）：离子强度弱则蛋白质溶解度低，以半透膜装母液，外浸蒸馏水，盐类往膜外透出，待膜内蛋白质溶解度降低，可望长出单晶。此法相当有效，值得首次尝试。前提是蛋白质不得变性（denature），有时添加少许 [0.02%(w/v)] 的 Sodium azide，或数滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止细菌的滋长。

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