2020年版黄精含量制备-打粉、称量、热乙醇、趁热滤过、挥醇与否、显色反应放冷时间

Trocy-zizi

  下面为黄精含量测定2020年版（和2015年版一致）的检验操作规程           【含量测定】        
         对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含无水葡萄糖0.33mg）。　　
         标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml具塞刻度试管中，各加水至2.0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法（通则0401），在582nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。　　
         测定法：取60℃干燥至恒重的本品细粉约0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150ml，置水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10ml，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150ml，置沸水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10ml，合并滤液与洗液，放冷，转移至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞干燥试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量（mg），计算，即得。   
  其中有几大问题想咨询请教各位老师和同行：
一）打粉制备。
  样品需要60℃干燥至恒重的细粉，我们的操作是切薄片，用60℃烘箱烘几个小时，时间视薄片干燥情况而定，然后打粉过5号筛，继续打粉过筛直至过不了5号筛，然后过4号筛，继续打粉过筛至过不了4号筛，全部粉末混匀，完全不能打碎的粉弃除。原则上不应该弃去粉末的，但是打粉研磨也不能碎的粉，接触面积小而重，混在一起不就影响提取率了吗？请问大家对于粉末的制备有什么更好的建议或指导呢？
二）恒重、称量。
  因样品具有吸湿性，采用含盖称量瓶进行干燥、恒重和减重称量法，用的不锈钢药勺，伸进圆底烧瓶内，用乙醇液冲洗着加够150ml。  同事的做法是用称量纸称量，整份放进烧瓶进行实验（涉及到后续挥干问题）。  此步同行们又是怎么操作的呢？可以探讨一下减少损耗，确保称重的准确性。
三）热乙醇。
   80%热乙醇的制备：取已配制好的80%乙醇溶液适量于合适容器中（我是100ml以内醇溶液于250ml锥形瓶），电热套或99℃水浴锅中回流加热。移除热源，待几分钟没有回流滴珠就拔掉回流管，此时醇溶液也是热的。
  请问热乙醇大家是怎么制备的呢？我这个方法应该能更好地保留配比而且比较安全吧？
四）趁热滤过。
  此规程中出现两次“趁热滤过”，一次是80%热乙醇（除杂），一次是热水（提取）。
  “趁热过滤”，理解为保温、快速、不损耗。我用抽滤法滤过醇溶液，常压法滤过水溶液（因为要放凉，怕损耗在回收瓶中），每次使用的热水都是新沸的热水。
  同事都是用常压过滤法，我也用过，比较耗时，因为滤过速率较低，滤纸内的溶液也容易降温。如果是常压操作，每次倒一部分进滤纸，都会放回水浴锅保温。
  此处思考是：实验室的趁热过滤一般会如何操作？抽滤会不会真的致使细粉损耗？用的中速大滤纸抽滤，不是与布氏漏斗同径的小滤纸，滤纸没有破损。
  （曾经做过对比试验，含量结果差不多，但现在的实验则比较低）
五）挥醇与否。
  多糖类的提取规程中，醇溶液和水溶液的两提取过程的文字描述全是逗号，没有句号，也没有说醇液是弃掉的，感觉规程不严谨。类似枸杞子，前面有乙醚液，会很明显地说明弃去乙醚液，挥干至无味。但醇溶液一字不达，意思是不需要挥干至无醇味，湿哒哒地直接加水？
  但根据操作经验和咨询多方实验室得知，大家都是默认弃去醇液，并挥干至无醇味。而挥干至无醇味的方法又有2种：
  ①滤纸和粉末置水浴锅表面挥干，圆底烧瓶水浴挥干，立干立移除，整个装置都在短时间内确保去醇；
  ②滤纸和粉末室温下放置至肉眼观察的挥干（程度因人而异），圆底烧瓶不管；
  各位老师和同行，看到规程的描述，你们又会怎么操作呢？是否会除醇呢？除醇的方式又是怎样的呢？
六）显色反应时间。
  本法使用硫酸蒽酮参与多糖的显色反应。从规程中得知，需要先冰水浴中缓慢滴加硫酸蒽酮，摇匀，然后放凉，沸水浴保温10min，再冰水浴保温10min，整个反应过程涉及到温度和时间。
  其中，冰水浴的制备方式是在提前制备的暴露性大冰块中加常温水，放置一段时间，冰微融化测温0-2℃开始实验。缓慢滴加的速度是1秒1-2滴，使用3ml的塑料滴管手动控制，单次双管操作。放凉是取出后置室温下回温至手触试管外壁不冰，与室温水触感相似，此处所需时间0.5-1h。沸水浴是水浴锅设置值100℃，温度计测量达标后使用。第二个冰水浴结束后，因为温度过低，不适宜立即实验（比色皿容易产生雾化现象），会放置40min，手触试管外壁无明显冷冻感，进行实验。有的实验室会放置1.5h甚至2h。
  此处疑问：
  ①各位老师或同行，对“冰水浴缓慢滴加硫酸蒽酮”的具体操作理解是？
  ②含硫酸的实验都不适宜久置，实验显示吸光度随着放置时间延长而增大。但是冰浴后又不适宜立刻实验，而每个实验室的控温和放冷时间不一样，结果差异会比较大，哪怕自己实验室操作稳定，但所谓的标准度在哪里其实是没法确定的，那紫外的数据可靠性是否还存在？
  黄精的提取制备已经做过很多次，但总会出现这样那样的关于细节方面的疑惑，现在把大概的疑惑都罗列出来，也把我们自己的做法展示出来，恳切希望能得到老师和同行们的热心指导。
  
  
  
  
  
  

Trocy-zizi

走过路过，回复其中一两个问题也是可以的哈

Trocy-zizi

Trocy-zizi 发表于 2021-03-12 16:56
走过路过，回复其中一两个问题也是可以的哈

电脑排的版，手机看有点错乱

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Trocy-zizi

关于（热乙醇）。
我是加热回流的方法制备，会让它煮沸。
同事是放置于流动相的含盖瓶子，扭紧盖子，水浴加热，没有煮沸。

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开始吧

谢谢分享，工作顺利

Trocy-zizi

开始吧 发表于 2021-03-15 07:58
谢谢分享，工作顺利

里面有提问的，请问可以稍微写下您对这些操作的理解或习惯吗

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灰德华国药

唉，我领导说热乙醇要扔掉的，然后一直不合格，药典么，也没有要也没说不要，真不严谨

衍一

灰德华国药 发表于 2021-11-11 17:51
唉，我领导说热乙醇要扔掉的，然后一直不合格，药典么，也没有要也没说不要，真不严谨

多糖不溶于乙醇，80％乙醇是为了除去有紫外吸收的杂质(如黄酮类成分），不除去会影响后面糖的测定

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老wen子

药典凡例中热水指70-80℃的水，我默认热乙醇也是这个温度，将配好的80%乙醇放到75℃的水浴锅保存，我测枸杞多糖也是这样操作的。另外我有些问题，我提取了几次两个样品之间平行性不好，我又重新打粉取样恒重，还是不太行。想问一下，紫外蒽酮显色的时候会严格控制每个样品放冷的时间么。硫酸蒽酮有没有更好地溶解方法?有什么更好地改善平行性的建议呢。

Trocy-zizi

老wen子 发表于 2022-9-13 10:58
药典凡例中热水指70-80℃的水，我默认热乙醇也是这个温度，将配好的80%乙醇放到75℃的水浴锅保存，我测枸杞 ...

你好，我这边不算严格控制样品放冷时间，但是也有在控制，一般是置冰水中待其刚凉下来没多久就拿出来，并且两管间的操作不要太久，稍微控制每管差不多的恢复常温的时间就好。硫酸蒽酮可用超声溶解。

老wen子

Trocy-zizi 发表于 2022-9-19 09:54
你好，我这边不算严格控制样品放冷时间，但是也有在控制，一般是置冰水中待其刚凉下来没多久就拿出来，并 ...

好的，非常感谢

18874536177

我们做酒黄精实验的重现性也不好，很难两次测到偏差范围内的数据，这个方法真的很让人头疼，太不稳定了，希望2025版药典能够改善黄精含量的检测方法

18874536177

1、片或剪碎成丝状烘干一天或一天一夜后直接打粉过6号筛，不能过的部分弃去，粉末装于自封袋，放干燥器内备用
2、回流是直接置于93度恒温水浴锅中回流，从滴第一滴开始计时，到点取出，普通过滤，洗涤液放水浴锅内加热至用的时候，手摸烫手（这一步没有温度计测量统一的温度，不知道是否对最后结果有影响），滤至没有滤液滴落为止，将滤纸擦拭锥形瓶瓶口后塞入锥形瓶内，用纯化水冲洗锥形瓶瓶口与内壁，加水至150ml，同上回流（水浴温度升至100度），回流完后直接滤至250ml容量瓶（减少中间转移损失），放冷后（有时候时间来不及会放盆里冷水冷却，不知道这样操作是否影响结果）定容。
3、蒽酮硫酸是将前面加液体步骤完成后再行配置，超声3分钟使溶解，直接用刻度移液管量取8ml蒽酮硫酸快速加入试管内，适当摇晃放于冰水浴中，待到所有试管都加完后放置在冰浴中等待两分钟，捆绑4支或3支一组，置于沸水浴中加热10分钟，沸腾开始计时，取出散放在冰水浴中，全部取出后开始计时
4、上机检测时，测一支从冰水浴中取出一支（夏天开空调、冬天不开空调室温，不会起雾）

Trocy-zizi

18874536177 发表于 2023-1-9 15:51
1、片或剪碎成丝状烘干一天或一天一夜后直接打粉过6号筛，不能过的部分弃去，粉末装于自封袋，放干燥器内备 ...

药材不可弃去，是取样量混匀后再按标准取样，药典通则也有提醒。哪怕你们厂房检验时弃去了，药检所也是不弃去的（除非各药检所的检验方法不一致），抽检时如果结果差异巨大是有风险的，和药检所做法不一致无法准确把控样品数据。我们也是切成丝后烘，一天打几次粉，基本过筛了，不能过的要混回去取样。

Trocy-zizi

18874536177 发表于 2023-1-9 15:51
1、片或剪碎成丝状烘干一天或一天一夜后直接打粉过6号筛，不能过的部分弃去，粉末装于自封袋，放干燥器内备 ...

其他操作基本类同，但是加硫酸蒽酮的步骤，药典明确要求“在冰水浴中缓缓滴加”，我们也试过沿壁缓慢直接流下去，效果确实还行，但和滴加的效果差异也是很大，所以不用这个方法。做到后面感觉成了玄学问题……

18928500799

谢谢分享！学习一下