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热原是微生物的代谢产物,是微生物的一种内毒素,其主要成分是脂多糖,分子量一般为106 左右。
去除热原的主要方法有:
11 高温法。多在250 ℃加热30 分钟以上。
21 酸碱法。用酸或碱进行处理,破坏热原。
31 吸附法。常用011 %～015 %的活性炭吸附处理。
41 层析法。利用离子交换树脂或分子筛凝胶层析处理。
51 超滤法。使用超滤装置滤除热原物质。
为了保证热原符合规定,往往要经过多次实验才能选择合适的方法,设计出适宜的工艺路线。在实际产品试制过程中,由于生化药物及基因工程药物多为核酸(核苷酸) 类和蛋白质(肽、氨基酸) 类物质,是微生物生长的优良培养基,控制热原成为一个生产难点。
控制热原可以从以下多个方面综合考虑:
1 在生产全过程中注意控制热原的整体水平
避免在过程中受到微生物污染可避免引入过多的热原物质。所有的去除热原的方法都是基于热原物质在一定水平下,如果热原污染严重,处理起来就相当困难。
药品生产的GMP 管理,有效地加强了在生产全过程中对热原的控制。生产环境洁净度的控制、物料存放时温度的控制等,现在生产过程中已能严格执行,而对于时间的控制则往往忽视了。在洁净百级的环境下,环境温度一般要求在18～26 ℃,沉降
菌允许3 个P皿(30 分钟) 。在此温度下,蛋白质、核酸类物质有利于微生物的繁殖,也就是说本已是无菌的原料或上一工序已无菌处理的物料,可能出现微生物的生长。因此根据长期的生产经验,要求物料(液) 在处理完毕后进行除菌过滤,而且从物料打开包装进行处理、配制到进行除菌过滤,时间宜控制在3 小时内,如处理后仍需冷藏的物料,则处理过程最好控制在2 小时内。 2 用具处理
一般教科书中所提供的方法对于已洗干净的物品均是适用的。而对于已污染微生物或久置未用的用具则需给予特别注意。即在清洗过程中,先使用一定的化学方法进行除热原处理。如用洗液浸泡15 分钟以上或1 %氢氧化钠溶液煮沸15 分钟(建议
不使用碳酸钠) ,处理完毕后用无热原水进行清洗。
3 选择去除原料、中间品中热原的方法
对于可能含有热原的原料或中间品,去除热原的方法受到多方面的限制。过酸、过碱、过热都会导致失活、降解、变性;吸附、超滤则导致含量损失、活性下降。常用的方法主要有凝胶过滤法、超滤法、吸附法。
311 凝胶过滤法
对于处理量少的样品(如几十毫升) ,在实验室
条件下,该法较为适用。可根据分子量和化学性质
选择凝胶(如Sephadex G75) ,凝胶在装柱前煮沸灭菌或用稀酸、稀碱洗涤,配制洗脱液的盐可用高温法除去热原,配液用无热原水(溶剂) ,洗脱液容器的通气口用无菌脱脂棉封口,当用鲎试验法检查层析柱平衡液的流出液内毒素反应呈阴性时,方可进行凝
胶过滤,过程中温度宜控制在10 ℃以下,过滤时间控制在3 小时内,并根据过滤时间来确定柱体积与上样量。曾测试层析时间为4 小时的蛋白质类物质除热原,热原符合规定。
312 超滤法
目前生产上已广泛使用超滤法去除热原,超滤膜截留孔径多选用7000～30000 分子量之间,效果较为令人满意。超滤装置与超滤膜的完整性是该法的关键。超滤前对样品进行预过滤以及超滤后即时进行清洗,可延长超滤膜的使用寿命。
对于组份复杂的蛋白质、肽类物质,超滤后,将发生一些变化。对于液态制成品,在贮存期内,可能会缓慢出现微量沉淀、白点、白块;对于固态制成品,则可能在溶解时存在微量不溶或白点、白块,从而导致澄明度不合格,这需在工艺中另行克服解决。可能的原因是:超滤前的物质的稳态系统,在超滤过程中部分物质被除去或是除去的比例不同,致使平衡破坏,造成另一部分物质析出而达到新的平衡。
超滤时还需注意的是pH。滤出液的pH 差值可能变化012 甚至015。另外,待超滤液的pH 不仅对超滤速度产生影响,还直接影响到产品收率、活性。
313 吸附法
吸附剂以活性碳最为常用,且成本低廉。活性碳吸附处理热原时的关键在于控制pH 与温度。活性碳的用量为011 %～015 % ,一般不必超过014 % ,用量较大时可分次加入。在使用前,将活性碳在180 ℃烘烤2 小时,一方面使活性碳本身去除热原,另一方面也使得活性碳活化,提高吸附力,使一定工艺条件下吸附力稳定。
活性碳吸附处理时,料液的pH 应控制在酸性条件下,此时去除热原的效果比较理想。考虑到对产品性质的影响,一般选择pH510～615。如料液终
点pH > 615 ,在活性碳吸附处理前,先将pH 调到pH615 以下;吸附处理后,去除活性碳,然后再回调pH 至终点pH。如在去除活性碳前就回调pH 至终点pH ,则可能使已吸附的热原物质发生解吸附,从
而使热原不合格。
活性碳吸附处理时的料液温度对吸附效果影响也十分重要。如pH610、40 ℃吸附处理20 分钟热原不合格的核酸类料液,于pH610、80 ℃吸附处理20分钟,热原可符合规定。如果料液性质允许,吸附处理的温度可尽量提高,相应的可缩短处理时间;如不宜高温处理,则可降低吸附处理时的pH ,并适当延长吸附时间。
通过pH、温度与吸附时间、活性碳用量的相互配合,在除去的同时,可使含量损失控制在10 %以内。
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发表于 2012-10-13 22:15:57
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