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问题1.复制（扩建）相同规模车间，生产同一产品是否符合相关法规？产场地中的同一生产地址内的生产场地新建，改建，扩建。变更药品生产场地的，药品的处方、生产工艺、质量标准等应当与原药品一致，持有人应当确保能够持续稳定生产出与原药品质量和疗效一致的产品，对于生物制品、多组分生化药、注射剂等高风险品种，以及仿制药一致性评价品种的生产场地变更，现场检查应当抽取1—3批样品送省级药品检验机构检验。 《药品上市后变更备案管理实施细则（试行）》（山西） 第二章 变更备案管理情形 第六条 变更药品生产场地，包括下列情形： （一）境内持有人或药品生产企业内部变更药品生产场地； （二）同一生产地址内的生产场地的新建、改建、扩建； （三）生产地址的改变或新增； （四）境内持有人变更生产企业（包括变更受托生产企业、增加受托生产企业、持有人自行生产变更为委托生产、委托生产变更为自行生产）。 第七条 药品生产过程变更包括生产设备、原辅料及包材来源和种类、生产环节技术参数、质量标准等变更，确定属于药品上市后备案类变更的，经备案后实施。 第八条 持有人药品说明书和包装标签变更涉及备案类变更事项的，按照《药品注册管理办法》《药品上市后变更管理办法（试行）》及药品说明书和标签管理的有关规定、技术要求和本细则规定执行，药品说明书和包装标签变更备案可与备案类变更申请一并同时提出。 第三章 变更备案管理程序 第九条 药品批准证明文件管理信息变更、药品生产过程变更、药品说明书和包装标签变更等属于注册管理备案类变更事项的，持有人按照《国家药监局关于药品注册网上申报的公告》（2020年第145号）有关要求，通过国家药品监督管理局（以下简称国家局）网上办事大厅药品业务应用系统（以下简称网办系统）进行“境内生产药品备案类”变更申报，并网上提交备案资料。 第十条 变更药品生产场地的，药品的处方、生产工艺、质量标准等应当与原药品一致，持有人应当确保能够持续稳定生产出与原药品质量和疗效一致的产品，并应按照下列不同情形提出申请： 第十二条 省局应当自备案完成之日起30日内完成对备案资料的审查，根据审查发现的风险情况组织开展专家论证、技术审评、现场检查、抽样检验。专家论证、技术审评、现场检查、样品检验的时间，不计入审核时限。 经审查，存在安全性、有效性和质量可控性风险隐患的，取消备案，并按《办法》第三十一条规定办理。对于生物制品、多组分生化药、注射剂等高风险品种，以及仿制药一致性评价品种的生产场地变更，现场检查应当抽取1—3批样品送省级药品检验机构检验。 问题2.两步灭活，出自ICH哪一章？《ICH Q7A》文件中 18.5条文指出 病毒的去除/灭活步骤中内容：18.50 更具体的资料参见ICH指南 Q5A“生物制品的质量：从人体或动物组织细胞族得到的生物制品的病毒安全性评估”。18.51对于某些工艺来说，病毒的去除和灭活是关键的工艺步骤，并按其验证过的参数进行。18.52 应当采取合适的预防措施来防止病毒去除/灭活前的步骤对病毒去除/灭活后的步骤的潜在病毒污染。因此，开口工艺应当在 与其它操作活动分开的，有独立的空气处理装置的区域内进行。 《ICH Q5A 来源于人或动物细胞系生物技术产品的病毒安全性评价》本文件旨在为从人或动物(即哺乳动物、鸟类、昆虫等)的特定细胞系制备的生物技术产品提供病毒安全性的测试和评价方法，本文件的范围涉及从特定细胞库引入的细胞培养物中所提取的产品，包括从体外细胞培养物所提取的产品，如干扰素、单克隆抗体和重组DNA产品(包括重组亚单位疫苗)，控制生物技术产品的潜在病毒污染，可归纳以下相互联系的三条原则： a)．对细胞系和其他原料，包括各种培养基，进行选择和测试，确保其不含可能对人有感染或致病作用的病毒。 b)对生产工艺中清除感染性病毒的能力进行评估。 c)在生产的适当步骤对产品进行测试，确保产品没有受感染性病毒的污染。 ICH Q5A文件对病毒清除阐述更详细，Q7A也附有病毒去除生产步骤。 问题3.完善单抗生产工艺、使用设备、以及工艺原理。3.1单克隆抗体单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。 3.1.1单克隆抗体上游技术流程1) 动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备； 2) 骨髓瘤细胞的获得与培养； 3) 细胞融合； 4) 融合细胞的筛选； 5) 克隆化培养； 6) 分泌抗体的融合细胞的筛选； 7) 单克隆抗体的大量生产。 3.2单抗下游生产工艺路线1) 种子复苏、扩培； 2) 细胞培养； 3) 收获； 4) 粗纯； 5) 低pH孵育； 6) 精纯； 7) 除病毒过滤； 8) 除菌过滤； 9) 原液分装。 3.2.1 种子复苏、扩培目前动物细胞一般保存于液氮罐中（－196℃），在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受细胞冷冻损伤，常用低温保护剂为DMSO，是一种渗透性保护剂，透入细胞，降低细胞的冰点，冻存和复苏的原则：慢冻速融，复苏过程应速融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶，下面是细胞复苏的常规操作步骤： 1) 细胞复扩培间进行常规消毒，紫外照射超净工作台30min； 2) 水浴锅打开，调节水温35.8℃-37℃； 3) 将新鲜培养基置于37℃恒温水浴锅中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将10 ml左右新鲜培养基移入无菌细胞培养瓶中，备用； 4) 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化，以70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内，复苏时使胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害； 5) 将细胞悬液移入已加培养基的细胞培养瓶中，放CO2培养箱中培养； 6) 待细胞贴壁后（根据细胞种类贴壁时间不同，一般4小时左右），弃去含有冷冻保护剂的培养基，加入新鲜培养基进行逐级放大培养。 3.2.2细胞培养3.2.2.1动物细胞培养特点动物细胞培养（Animal cell culture） 是模拟体内生理环境使分离的动物细胞在体外生存、增殖的一门技术，通常动物细胞体外培养具有以下特点： 1) 动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感； 2) 动物细胞生长缓慢，易受污染； 3) 动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要 贴附在载体表面才能生长，体外生长的动物细胞一般具有贴附、细胞接触性抑制、密度抑制的特点。 3.2.2.2动物细胞培养的条件同微生物、植物细胞培养不同，动物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受高温灭菌，多采用过滤除菌（例如支原体污染），因此需要特殊的滤器。 1.培养基：动物细胞培养对于营养要求非常苛刻，需要氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子等。培养基包括三种类型： 1) 天然培养基：主要是动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液、鸡胚胎汁等，优点：营养价值高， 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高。 2) 合成培养基：优点：成分已知，便于对实验条件进行控制；缺点：无法替代一些未知成分；解决途径：合成培养基中添加小牛血清，彼此互补。目前常用合成培养基包括MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等。合成培养基举例，DMEM培养基：由杜尔贝科等在MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的含量，根据葡萄糖高低分为高糖型（4,500 mg/L）适合生长较快、贴附性差的细胞培养（例如肿瘤细胞）；低糖型（1,000 mg/L。 3) 无血清培养基：无血清培养基是不含血清的动物细胞 培养基，由基础培养基和添加组分组成。添加组分主要包括：细胞外基质、生长因子、结合蛋白与转运蛋白、酶抑制剂等。 2.其他溶液：平衡盐溶液、培养基pH调整液、抗生素溶液： 1) 平衡盐溶液：主要由无机盐组成，具有维持细胞渗透压、 调控培养液酸、碱度平衡的功能。 2) 培养基pH调整液：大部分合成培养液都呈微酸性，常用pH调整液有：NaHCO3溶液：3.7%、5.6%、7.4%；HEPES液：HEPES是一种非离子两性缓冲液 其在pH 7.2 -7.4 范围内具有较好的缓冲能力 中文名：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。 3) 抗生素溶液：防止微生物污染。常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素。 3.2.2.3动物细胞培养方式目前主要有三大类培养方式：贴壁培养、固定化培养、悬浮培养。 1) 贴壁培养：是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。优点：容易更换培养液；容易采用灌注式培养、 不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有类型细胞。缺点：扩大培养比较困难、投资大； 占地面积大；不能有效监测细胞的生长。贴壁材料：具有亲水性、正电荷。常用材料：硅硼酸玻璃（卡氏培养瓶等）；聚苯乙烯（96孔培养板等）。 2) 固定化培养：可以采用类似植物细胞固定化培养的方法 对动物细胞进行固定化培养，具有细胞生长密度高抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。 3) 悬浮培养：是指细胞在反应器中自由悬浮生长，主要用于非贴壁依赖型细胞培养，杂交瘤细胞、血液白细胞淋巴细胞某些肿瘤细胞等属于此类细胞；贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后，可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。 3.2.2.4动物细胞培养的生物反应器主要有以下几种生物反应器：常规机械搅拌式生物反应器，中空纤维生物反应器，微载体培养生物反应器。 1) 机械搅拌式生物反应器：这种类型的生 物反应器搅拌 速度一般都非低，尽量减少剪切力对细胞的影响。 2) 中空纤维生物反应器：中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜,主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口,优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效率高,缺点：容易堵塞，价钱昂贵。模拟细胞在体内生长的三维状态。既可用于悬浮细胞的培养又可用于贴壁细胞的培养。细胞如果是附壁性的，则附着在纤维外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将其截留在反应器内而让培养液排出。 3) 微载体培养生物反应器：直径60-250μm的微载体，是适用于贴避依赖型细胞生长的微粒，一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 a. 微载体特点：无毒无害，有好的黏附性，一般带正电荷；大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一；好的热稳定性：高压灭菌； b. 微载体制备材料：人工合成聚合物：聚甲基丙烯酸-2 羟乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等；天然聚合物及其衍生物：明胶、胶原、纤维素、甲壳质及其衍生物、海藻酸盐。 c. 微载体培养关键：细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖；黏附主要是靠静电引力和范德华力。 d. 微载体培养优点：模拟了体内三维生长环境，减轻了接触抑制，可以多层生长；很好地解决了生物反应器的空间分布问题，单位体 积培养液的细胞产率高；培养系统占地面积和空间小；劳动强度小；放大容易，使大规模培养动物细胞成为可能。把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼有两者的优点；可以稍加改造利用传统生物反应器。接种与收获方便；可循环、连续收获与培养，培养基利用率较高。 3.2.3收获单克隆抗体生产的细胞培养阶段目前多采用悬浮细胞高密度培养，细胞培养完成后所获得的含有抗体的细胞培养液会含有蛋白酶、宿主细胞、细胞碎片等污染物，影响抗体的稳定性和纯度。 需要经过去除使细胞液澄清后才能用于后续的抗体分离纯化过程。细胞培养液澄清的方法有很多，比如中空纤维过滤，表面过滤，深层过滤等，而深层过滤是目前国内外单抗生产细胞培养液澄清的主要方法培养体积在1000L以内可以直接选择深层过滤技术来处理，如果培养体积较大可以选择离心和深层过滤结合的方式处理料液。 深层过滤指的是利用多孔介质从流动相中截留固体颗粒而不是表面截留，且一般介质表面都带有正电荷，可以通过静电吸附的方式来拦截杂质颗粒。深层过滤一般应用介质层较厚的滤床类(如沙层、硅藻土等)作为过滤介质，小于介质空隙的颗粒可进入到介质内部，而长而曲折的孔道中被截留并附着于介质之上。 目前行业内拥有深层过滤介质产品的公司包括赛多利斯，默克密理博，PALL，3M等公司。 赛多利斯深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损；采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。 默克密理博深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂（聚丙稀粘合的硅藻土）组成，包裹在聚丙烯外壳内；它由两层全厚度深层滤板（上游一层粗过滤和下游一层精细过滤）组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。 PALL深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成；也由两层全厚度深层滤板（上游一层粗过滤和下游一层精细过滤）组成。 3.2.4粗纯目前治疗用单抗大部分使用亲和层析作为第一步纯化首选，一步层析的纯度通常可以达到90%以上，一步层析可除掉HCP（宿主细胞蛋白）98%以上。 Protein A填料具有高亲和性、可操作性、可放大性等特点，因此几乎所有商业批准单抗制造工艺均使用Protein A填料捕获作为下游纯化的初始步骤。Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，它含有5个可以和抗体lgG的FC段特异性结合的结构域,，每个Protein A分子至少可以结合两个IgG分子，因此将Protein A与琼脂糖凝胶以一定方式结合，用于抗体纯化的亲和填料。 随着技术的发展，Protein A在不断的改进，目前用于单抗捕获的重组Protein A多点和琼脂糖微球等填料基质偶联，减少了使用过程中配基脱落，同时为满足生物制药工艺消毒的要求，可以耐受0.1-0.5M氢氧化钠的处理。要特别注意，不同厂家的Protein A亲和层析填料在Protein A的耐碱性，结构序列，和填料基质偶联方式，结合载量，配基脱落率等方面存在较大差异，在选择Protein A亲和层析填料时一定要系统考量。 3.2.5低pH孵育ICH指导委员会 ICHQ5A（R1）来源于人或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评价中指出本从特定细胞库引入的细胞培养物中所提取的产品，包括从体外细胞培养物所提取的产品，如干扰素、单克隆抗体和重组DNA产品(包括重组亚单位疫苗)，控制生物技术产品的潜在病毒污染，可归纳以下相互联系的三条原则： a)．对细胞系和其他原料，包括各种培养基，进行选择和测试，确保其不含可能对人有感染或致病作用的病毒。 b)对生产工艺中清除感染性病毒的能力进行评估。 c)在生产的适当步骤对产品进行测试，确保产品没有受感染性病毒的污染。 单抗制品的病毒污染可能由细胞系、物料或者在生产过程中偶然引入。为确保产品的安全性，需以风险评估及全过程控制的理念控制内源性和外源性的潜在病毒污染。外源因子： 系经无意中引入于接种物、细胞基质和（或）生产制品所用的原材料及制品中的、可复制或增殖的污染物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等，低pH（＜3.8）孵育已被证明是一种有效的病毒灭活方法。低pH灭活要考虑的参数有：pH、孵育时间、孵育温度、调酸buffer、蛋白浓度、含盐量（NaCl）、蛋白PI等。 1) 低pH孵育进行病毒灭活的原理：低pH孵育是专属的病毒灭活步骤，对包膜病毒有极强的灭活作用。低pH造成病毒包膜上的蛋白结构、膜结构、衣壳结构变化，从而去除病毒的传染能力；低pH孵育步骤可以方便地置于ProteinA层析后，在低pH洗脱液的基础上，调整pH，进行0.5-2小时的孵育；pH孵育对鼠细小病毒等无包膜病毒没有明显的灭活效果。 2) 低pH对抗体有多种不利影响，包括促进抗体聚集、断裂、加速脱酰胺化等，所有在确定孵育pH、孵育时间等参数上，需要平衡考虑对病毒灭活和抗体质量的影响；低pH孵育完成后，利用Tris等弱碱溶液进行中和。在中和过程中常会伴有沉淀产生，这些沉淀主要是宿主细胞蛋白和核酸等杂质，可通过深层过滤去除。增大细胞分离步骤使用的深层过滤面积可以减轻pH中和步骤沉淀产生。 3) 赛多利斯的新型一次性混合系统包含磁力混合系统和磁悬浮系统，两者均可提供50L-1000L不同体积大小的选择，满足该工艺从研发、中试到生产逐步放大的需求。另外，混合系统还可以与FlexAct自动控制平台整合，实现低pH孵放病毒灭活的全自动控制，使得整个工艺更加快速、安全、高效。 3.2.6精纯阴阳离子两步层析--- CEX、AEX，离子交换层析通过带电溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换达到分离纯化的目的。 层析基质一般采用的是纤维素或葡聚糖凝胶等物质，通过酯化、醚化或氧化等化学反应，引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂，因而，可与带相反电荷的化学物质进行交换吸附。离子交换剂在水中呈不溶解状态，能释放出反离子，同时与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合吸附，结合后不会改变离子交换剂本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。 蛋白质属于两性电解质，所带电荷取决于所处缓冲液的pH大小。当蛋白质等电点大于其所在缓冲液pH时，蛋白质带正电荷，应选用阳离子交换剂；当蛋白质等电点小于其所在缓冲液pH时，蛋白质带负电荷，应选用阴离子交换剂。 ①阳离子层析CEX（吸附模式）：抗体在pH＜PI条件下带正电荷，可与阳离子交换剂结合；上样完毕后，可用一定盐梯度的缓冲液将目的蛋白洗脱下来，其主要去除聚体、抗体片段、残留Protein A、部分HCP。1M NaCl通常用于阳柱的再生。 ②阴离子层析：AEX（流穿模式）:抗体在pH＜PI条件下带正电荷，与阴离子交换剂不结合，直接流穿；大部分HCP的PI＜pH，带负电荷，与阴离子交换剂结合；在此条件下残留DNA、内毒素也能结合在柱子上；因此，AEX主要去除残留DNA、HCP和病毒（＞4Log）。流穿模式的条件为：pH低于PI 0.5～1个单位，电导＜7.5ms/cm; 相关实验数据表明：电导越低，HCP清除率越高；pH越高电导越高，都会使蛋白趋于结合柱子。 蛋白层析系统中，柱再生，上样前平衡，上样洗脱，分别起什么作用？ 打个比方你想在冰箱里冷冻东西A（目标蛋白），同时还有一些杂质B、C（杂质蛋白）等冷冻之后才好清除。再生就是把冰箱里乱七八糟的东西清干净，以便再往里面装东西；平衡就是先把冰箱降温下来，免得A装进去变质了或者人家不愿意入住（假设A有思想）；上样就是装A的过程（同时B\C也装进去了）；洗脱就是经过冷冻之后，将A\B\C分开拿出来，不同蛋白PI不同使用缓冲液调节pH将蛋白分别洗下来。 3.2.7除病毒过滤国际上保证产品病毒安全性的主要原则是基于美国、欧盟和日本用药品注册协调大会标准(ICHQ5A)。该指南文件为病毒安全性建立了世界范围的标准，其中ICH Q5A 生物技术产品的病毒安全性评价部分，详细描述了对于内源性/外源性病毒的检测和测试方法，以及病毒清除程序的评价和鉴定方法。 目前在常见的药物病毒去除手段中，纳米膜过滤技术可作为一种有效的清除病毒的物理步骤，由于其操作简单温和，机制明确，易于验证等优点，已被广泛用于纯化工艺中的病毒安全保障。当前应用较为广泛的是截留孔径为20nm的除病毒过滤器，它是以大小排阻的机制实现病毒清除，其作用机制是基于病毒大于滤膜孔径，产品穿过滤膜而病毒被滞留，可去除带包膜或不带包膜的病毒，同时基于病毒大小的清除机制，除病毒滤膜20nm的截留孔径，不仅仅可以用来有效清除细小病毒，同时也能够有效地去除直径80～100nm的小鼠白血病病毒以及其余种类的病毒颗粒。 科百特Viruclear VF采用连续梯度结构PES膜，大幅度提高纳污空间，对于聚体等大颗粒工艺杂质具有较强的截留能力，下游由20nm精度的滤膜组成，孔径分布均匀，可以实现对于细小病毒的稳健截留能力，更好的应对压力中断等极端过滤测试挑战。Viruclear VF除病毒过滤膜采用高亲水性配方，有效的提高了PES膜的亲水性，对于高浓度、较疏水物料的过滤具有更高的通量和载量。
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发表于 2021-12-17 09:51:32
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