求助|灵芝的紫外加样回收实验问题

白花前胡

各位大佬好，我这边在做一个跟灵芝有关的紫外加样回收实验，实验方案就是在“《中国药典》2020版-灵芝的紫外分光光度法测定灵芝多糖的含量”的基础上进行修改的，修改内容是将“加入药材粉末2g”改为“加入药材粉末1g及对应量的对照品溶液”，做出来的回收率只有百分之四十几
然后我这边也尝试了在不加药材粉末的情况下直接加入200%的对照品溶液，结果是测不出，紫外上测出来的吸光度是负数（可以忽略不计相当于测不出来）


想问一下各位大佬有没有做过类似实验的，有什么问题


附实验方案

取药材粉末约1g，精密称定，置圆底烧瓶中，同时加入一定量的无水葡萄糖对照品溶液（加样量见下表），加水60mL，静置1h，加热回流4h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60mL，加热回流3h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75mL，摇匀，在4℃放置12h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液2mL，置25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

精密量取供试品溶液2mL，置10mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1g，加硫酸100mL使溶解，摇匀）6mL，立即摇匀，放置15min后，立即置冰浴中冷却15min，取出，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

序号	供试品质量g	对照品质量mg
80%-1	1	11.2
80%-2	1	11.2
100%-1	1	14
100%-2	1	14
120%-1	1	16.8
120%-2	1	16.8

wnccgh

灵芝多糖供试品制备中，残渣加水溶解后加乙醇沉淀的目的是利用多糖难溶于醇而单糖可溶于醇的原理，加乙醇之后再4℃冷藏的目的是把多糖沉降下来。你做加样回收的时候，这一步是否有沉淀产生？如果没有沉淀则说明葡萄糖都溶解在乙醇里了。

白花前胡

wnccgh 发表于 2022-8-1 10:51
灵芝多糖供试品制备中，残渣加水溶解后加乙醇沉淀的目的是利用多糖难溶于醇而单糖可溶于醇的原理，加乙醇之 ...

我记得葡萄糖是微溶于乙醇中的，只是不太清楚葡萄糖在乙醇中的溶解度是多少，第一次离心是好像有沉淀出来的，但是最后测的时候就是测不出来，并且做加样回收的时候也是对照品加得越多，回收率越低

wnccgh

白花前胡 发表于 2022-8-1 11:06
我记得葡萄糖是微溶于乙醇中的，只是不太清楚葡萄糖在乙醇中的溶解度是多少，第一次离心是好像有沉淀出来 ...

葡萄糖的确在乙醇中微溶，药典凡例讲到微溶指的是“溶质1g（ml）能在溶剂100~不到1000ml中溶解”，也就是千分之一到百分之一的溶解度。我看你实验方案的表格里写到对照品最多加了16.8mg，即便按照千分之一的溶解度计算的话，也只需要16.8ml乙醇即可全部溶解，况且这一步需要加5ml和75ml乙醇，这个体积可以将无水葡萄糖全部溶解了。

白花前胡

wnccgh 发表于 2022-8-1 13:30
葡萄糖的确在乙醇中微溶，药典凡例讲到微溶指的是“溶质1g（ml）能在溶剂100~不到1000ml中溶解”，也就是 ...

大概猜到这个情况了，也怪我当初没想这么多，谢谢啦