生物药免疫原性分析中的底层逻辑与方法论

IPPM小助手 · 发表于 2022-11-9 14:03:43

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本帖最后由 IPPM小助手于 2022-11-10 08:56 编辑

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蒲公英上海医药服务共创平台系列课程第六期：《生物药免疫原性分析中的底层逻辑与方法论》，邀请上海派思维新生物医药科技有限公司体外部门主管王正宇老师，派思维新生物设备针对课程中收集的问题予以解答，供大家学习和探讨。

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Q1：基于国家的相关CDE指导原则，能大概谈一下ADA针对性的检测指导验证需求有哪些？

A1：抗药抗体的检测需要进行谨慎且前瞻性的设计和计划，包括分析方法的选择和开发、合适的采样点、充足的采样体积、样本采集的流程及储存方法、以及数据分析选用的统计学方法。在试验设计上，抗药抗体的检测一般采用层级递进的评估策略，先进行筛选实验，然后对筛选为阳性的样本做进一步的结合特异性的确认分析，若确证为阳性，则继续进行抗药抗体的滴度分析和中和活性的分析。其中，在已确证为抗体阳性的样本中，有时还应考虑对抗体的同种型、亚型和结合表位等指标进行检测分析。具体的检测细节和要求，大家可以参考国家药品监督管理局于2021年颁布的《药物免疫原性研究技术指导原则》。

Q2：哪些类型的药物一定需要做ADA？

A2：主要是生物药，包括蛋白、抗体、抗体偶联、多肽、疫苗相关的药物。

Q3：可以谈一下针对ADA需要的相关阳性对照吗？

A3：ADA方法学验证中的某些重要参数高度依赖于阳性对照样品的选择，但具体的样品分析结果在检测的可信度方面，却又不依赖于所选择的阳性对照样品，而是高度依赖于我们所开发出来的具体实验方法，即某种方法在检测灵敏度、药物耐受水平、抗基质干扰能力等方面是否比别的形式的方法更具优越性。因此，对于ADA分析需要的相关阳性对照在来源的选择上，并不需要经过太过严苛的筛选，可以是从商业公司处购买获得，也可以是从免疫动物的过程当中制备获得。阳性对照样品主要为分析方法的开发和验证提供一些重要的支撑方面的信息，但却不作为评判样品分析结果是否可信的依据。当然，在原则上，我们也应尽可能地去优先考虑选择购买或制备在分子结构上更加接近于动物或人体内真实抗药抗体结构的阳性对照抗体。

Q4：ADA方法学验证这里LPC定值是如何确定的呢？

A4：采用独立重复试验对阳性对照样品做滴度曲线，以线性拟合的方式对高于筛选点临界值的阳性对照样品的浓度和低于筛选点临界值的阳性对照样品的浓度做回归分析，计算得到筛选临界值处阳性对照样品的浓度具体值，然后采用t统计分布并以99%或99.9%的分位数来计算得到LPC的定值。

Q5：筛选试验、确证试验、滴度试验是用同一套免疫分析方法吗？

A5：是的。

Q6：怎么考量待测样本的稀释比例以达到最佳免疫原性检测效果？

A6：在方法开发的过程当中，往空白基质里面外加阳性对照样品，然后用分析缓冲液对该样品做系列稀释，如2， 4， 8，16，…，100倍稀释，得到各稀释倍数下的样品检测响应值。然后以阳性对照滴度曲线为参考，通过回归分析和校正，得到各稀释倍数下的样品检测浓度值。观察浓度随稀释倍数变化的曲线，以最先到达曲线上平台的稀释倍数作为样本检测的最佳稀释比例，即最小稀释倍数（MRD)。

Q7：筛选灵敏度和确证灵敏度实验怎么做？和滴度精密度放在同一块96孔分析板上吗？

A7：筛选灵敏度和确证灵敏度试验的做法同LPC定值试验的做法类似（见问题4中的答复），即采用独立重复试验对阳性对照样品做滴度曲线，以线性拟合的方式对高于筛选/确认点临界值的阳性对照样品的浓度和低于筛选/确认点临界值的阳性对照样品的浓度做回归分析，计算得到筛选/确认临界值处阳性对照样品的浓度具体值，此即为筛选/确证灵敏度。筛选灵敏度、确证灵敏度试验和滴度精密度试验于同一块96孔分析板上进行分析。

Q8：双抗原夹心法检测抗体的缺陷能否谈一下？

A8：当抗原和待检测的抗体都有两个可供结合的位点时，用于捕获抗体的捕获抗原可能会把抗体中的两个结合位点都给占据了，以至于用于信号放大的检测抗原没法再和抗体进行继续结合而使方法的灵敏度有所降低。

Q9：体外细胞因子释放试验主要检测哪些因子？

A9：IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ 和 TNF-α。

Q10：一个混合蛋白的ADA，是否需要分来不同蛋白检测，可否设计试验在一个孔上进行筛选阳性检测，然后再用不同蛋白进行确证性试验进一步区分？这样阳性对照又该如何制备？

A10：筛选试验和确认试验都用的是同一套免疫分析方法。因此，我们可以考虑开发一种用于同一个孔内检测混合蛋白ADA的分析方法，同时，应用该方法去对由混合蛋白免疫产生的ADA做进一步的特异性确认分析。但应注意，我们这里检测、评估的ADA是相对于混合蛋白而言的，因此，这里的检测结果，就只具备有“混合蛋白”免疫原性的相对评估意义而不具备有它义。受吸附板载量和检测抗体浓度等因素的影响，我们开发出来的用于同一个孔内检测混合蛋白ADA的分析方法在分析某个单一蛋白所致的免疫原性结果上相对于开发出来的用于分析单一蛋白免疫原性结果的分析方法而言，在检测灵敏度方面可能会有所下降，因此，如果我们想要深入了解混合蛋白中不同蛋白的免疫原性结果，最好还是开发针对性的单一蛋白检测方法去评估混合蛋白中不同蛋白的免疫原性结果。

Q11：间接法测抗体，阳性参考品是否要做人源化改造？

A11：对这方面的要求不做硬性上面的规定，但在原则上，我们应尽可能地去优先考虑选择购买或制备在分子结构上更加接近于动物或人体内真实抗药抗体结构的阳性对照抗体。具体考量逻辑见”问题3”中的答复。

Q12：ADA检测对生物样本采集的时间点有什么要求？

A12：ADA检测的生物样本采集时间点在设计上应与PK, PD样本的采集放在一起考虑。对于IgG检测，样本采集通常建议在第一次给药暴露后3-6周；而IgA反应可以更早，通常在第一次暴露后的2-3周。对于半衰期长与高风险的药物，ADA检测需要克服高浓度药物的干扰。因此，可以考虑通过提高方法的耐药性以及选择合理的样本采集时间（如尽量晚的样品采集时间来降低药物浓度）来提高样品检测的准确性。此外，对于高风险药物的免疫原性评估，在临床试验中需要考虑ADA形成的动力学进行ADA检测，从而为预测与评估ADA产生的风险提供充分的依据。

Q13：双抗夹心中双抗该怎么选择，还有验证时准确度的加标该怎么做?

A13：ADA检测中的“双抗”，一般即指药物。因为抗药抗体的检测采用的是层级递进的评估策略和定性半定量的检测方式，因此，在指导原则中，只涉及到分析方法的精密度验证而未涉及分析方法的准确度的考察。实际评估的过程当中，对于加标准确性的考量，可以放在方法开发的过程当中来完成，即在评估基质对检测方法的干扰时，通过MRD试验（见”问题6“）来看最小稀释倍数处样品的加样回收情况。

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