【镁伽杯】药品研发从从小试到中试到放大经验分享之微生物发酵工艺

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微生物发酵即是指利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为所需要的产物的过程。

个人理解的微生物发酵工艺包括三部分，其一是优良种株的选育，并确定初步发酵条件，如起始碳源、氮源，好氧情况及代谢途径，营养需求与初步培养基组成，此部分一般包括基因工程路线设计、菌株改造与筛选、摇瓶条件摸索；其二是发酵放大研究，摸索出最适发酵工艺（种子培养和生产培养）利用密集细胞培养生产代谢产物，此部分开始于实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，再根据模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计放大，落脚于生产规模的动力学模型，得出最大产量、转化率与生产强度。由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多放大问题，解决这些问题是微生物发酵工艺开发的关键所在；其三是发酵液分离纯化技术，制定合适的工艺拿出合格的产品。

一般地，现代基因工程菌株改良质粒直接导入后对于菌种的稳定传代要求较高，发酵放大时每一步也需要考虑比生长速率，具体地需控制OD生长速度，过慢不利于发酵，而过快质粒容易丢失；而染色体改造，适当敲除一些基因，改变目标产物前体、目标产物的代谢流有时也是菌株改良的必需。稳定性提升可能会降低转化率指标，合适的发酵工艺可以缩小降低量。

摸索发酵最适条件，包括最适菌体生长温度与最适生产温度，摸索最适生长pH与最适生产pH，最适生长好氧与最适生产好氧控制。将最适生长温度与最适生产温度分开，一般地最适生产温度可比生长温度低6-8℃，这样稳定了质粒传代也提升了组酶的整体效率并延长了产物周期，另发酵后期相比与中期可略升高2-3℃，以提升生产强度；各不同底盘菌种的最适生产pH略有不同，且最适生产pH需结合组酶的活性及目标产物积累后对于pH影响，如氨基酸发酵的种子生长阶段pH控制近中性而产物阶段略低，萜类发酵可能恰恰相反；最适生长好氧状态，不能局限于代谢理论，需大量摸索这关乎菌体生产、底物转化率、生产强度与杂质生成，有些发酵工艺是根据溶氧反馈控制补料，一般溶氧控制在15-30%，有些发酵工艺以维持溶氧为纲根据菌丝形态增加或者降低搅拌而相应地减少或者增加通风，一般地生产时的通风比在0.6-1.2VV/min，而生长时可在1VV/min以上。

发酵液分离纯化还是遵循先提取后纯化整体思路，固液分离、杂质分离及重结晶。离心压榨过滤，两相萃取、树脂柱层析，超滤纳滤及沉淀结晶、冷冻干燥等都是技术手段。现在微生物下游的效率及产品质量也是评价整个工艺开发的一个首要指标。如杂质方面，在菌株设计阶段就需要考虑类似物质的代谢，选择类似产物积累较少的菌株；在发酵工艺放大时，也需要考虑减少及增加类似产物积累的工艺条件，并尽可能避免之，或者说平衡之。

实践是检验真理的唯一标准。在微生物发酵工艺开发阶段，每批发酵时，可以多做些前瞻后延的尝试。如提倡种子培养基与发酵培养基接近，以解决微生物适应性问题，但是这样的种子培养基不一定是最佳；原理上消耗TPP较多的路线在发酵不同阶段不一定都是高溶氧好，更不一定是高转速好；样品处理时摸索酸碱及温度对产品的影响，同一样品开发气相、液相双方法及多方法对比；关注后期发酵液状态、产物峰谱图，指导发酵下游技术等等。

微生物发酵工艺开发的三部分又不是物理分割的，发酵实验时可根据转化率情况、生产强度情况，对菌株提出进一步改良的可能；也可根据产物杂质情况，对菌株提出进一步改良的必要；发酵放大时分析不同阶段、周期的发酵状态，选择合适的控制方法也可为后续的分离纯化简化路线提供可能。微生物发酵工艺开发，以发酵放大为承前启后的关键；发酵工艺小试、中试到放大，以解决各级放大问题为工艺完善提升的首要抓手。

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蒲公英征文组

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