宿主细胞残留DNA片段大小分布之毛细管电泳分析法

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背景介绍

宿主细胞残留 DNA 是指可能出现于生物制品中的来自宿主细胞的 DNA 片段。其可能的致癌性、传染性及免疫原性对细胞培养的生物制品造成了潜在的安全隐患[1,2]。目前 WHO 和各国药物注册监管机构均对重组蛋白、疫苗、抗体、基因治疗等生物制品的宿主细胞残留 DNA 提出了监测和控制要求，以确保生物制品的安全性及质量可控性。除需对 DNA 片段的残留量进行控制外，DNA 片段大小分布也是确定其相关风险因素的重要指标。我国药监局于 2022 年 5 月试行的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中明确指出“要对 DNA 残留量和残留片段的大小进行控制，建议尽量将残留 DNA 控制在 10 ng/剂内，DNA 残留片段的大小控制在 200bp 以内”。目前，已有多种成熟方法可检测宿主细胞残留 DNA 含量，包括阈值法、杂交法及实时定量 PCR 法等。但对残留片段大小的检测与分析，目前还没有特定推荐的方法。

宿主细胞残留 DNA 片段大小分析方案

上海测简奕和安捷伦联合开发了宿主细胞残留 DNA 片段大小分析方案。该方案应用测简奕开发的宿主细胞残留 DNA 样品前处理专用试剂盒，搭配安捷伦 Fragment Analyzer 片段分析仪、配套检测试剂盒以及分析软件，能准确分析残留 DNA 的片段大小范围和相对含量，操作简单，结果直观。

1.分得开

可实现 1 bp – 50 kb DNA 片段的分离及检测。

2.测得准

通过 DNA 片段标准品实测结果（图 1、表 1）与理论值对比，各片段大小的准确度在 96% - 99% 之间（图 2a），相对含量的准确度在 81% - 99% 之间（图 2b）。

图 1. DNA 片段标准品（测简奕提供）电泳图

表 1. DNA 片段标准品分析结果与理论值对比

图 2a. DNA 片段标准品片段大小准确度

图 2b. DNA 片段标准品相对含量准确度

3.通量高

最快 50 分钟内可完成 96 个独立样本的分离及检测。

应用实例

通过本文的检测方案，我们分析了细胞培养液上清中宿主残留 DNA 的片段大小分布,以用来评估安全性风险并优化生产工艺流程。从实验结果（图 3、表 2）可见，大部分残留的宿主 DNA 片段均为安全风险等级较低的小片段（200 bp以下）。

图 3. 细胞培养上清液电泳图

表 2. 细胞培养液残留 DNA 片段大小分布比例

安捷伦片段分析仪介绍

安捷伦片段分析仪系统采用自动化并行毛细管电泳技术，可通过配合使用专属试剂盒定性和定量分析 DNA 或 RNA 样品，如质粒、基因组 DNA、总 RNA，小 RNA、CRISPR 编辑 RNA、大 DNA 片段等。毛细管阵列是片段分析仪系统的基础。填充凝胶后，首次进样施加电压，然后 DNA 或 RNA 样品根据其分子量大小通过各个毛细管实现分离。当片段通过检测窗口时，高灵敏度电荷耦合检测器 (CCD) 将采集片段的荧光信号，最后通过 ProSize 数据分析软件包自动计算片段大小以及定量分析结果。安捷伦提供的三种型号的片段分析仪系统（通量和自动化程度不同），可满足不同实验室的检测分析需求。

参考文献

[1] World Health Organization (WHO) Meeting Re-port. Study Group on Cell Substrates for Production of Biologicals. June 11–12, 2007; pp 1–30.

[2] FDA Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, February 2010.

安捷伦科技与测简奕科技成立生物制药先进技术联合实验室，致力于共同开发生物制药质量研究、过程监控等完整解决方案，解决生物医药质量分析和工艺研发的痛点和难点，满足客户不断增长的需求。

关于测简奕

上海测简奕科技有限公司是一家大分子药物领域的技术公司，汇聚了行业经验丰富并具有创新思维的核心技术团队，致力于打造基于“核心杂质监测与清除”技术的创新型生物医药CTDO公司，为生物制药的客户提供全产业链技术服务和产品。公司建立了“发现杂质、识别杂质和清除杂质”的核心技术平台，也可为蛋白药物、疫苗和基因/细胞治疗提供全生命周期的质量研究和控制服务。同时，公司自主研发的蛋白快速酶解试剂盒、细胞培养分析试剂盒、HCD和HCP检测试剂盒等产品，可大大提高生物医药研发效率，降低成本。目前，公司已为超过200家客户提供了服务和产品，服务项目数目超过500个，其中IND申报项目超过50个。公司已获得国家CNAS体系、高新技术企业和上海市科技型中小企业认证。

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有些检测HCD残留的采用qPCR法，该种方法估计还只能作为内控标准，期待后续的展开

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学习了，谢谢提供分享。