【耀文解读】中检院最新发表mRNA-LNP脂质组分检测方法：HPLC-CAD

耀海微生物cdmo

导读：[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]脂质纳米颗粒（LNP）是目前最为先进的mRNA递送系统，能够提高mRNA疫苗的稳定性和细胞递送能力。最早上市的两款mRNA疫苗中的LNP组分分别为：mRNA1273（SM-102、PEG2000-DMG、DSPC和Cholesterol），BNT162b2（ALC-0315、ALC-0159、DSPC和Cholesterol）。对单个脂质组分进行鉴别和定量检测不仅支持工艺和配方开发，也是疫苗生产的关键质量属性。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2023年，美国药典USP更新的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”草案中建议使用CAD检测器鉴别脂质组分、定量检测各组分含量。2023年5月，中国食品药品检定研究院（中检院）联合赛默飞在Vaccines杂志 [IF:7.8] 发文：《Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines》。研究者开发并验证了一种HPLC-CAD方法，用于鉴别和定量测定一款mRNA-LNP疫苗中四种脂质的含量，旨在为mRNA新药和疫苗的开发提供方法支持。一、LNP递送系统简介

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]mRNA疫苗递送的LNPs系统，使用以下四种类型的脂质体：可电离脂质、PEG化脂质、两性离子辅助磷脂和胆固醇。Moderna和Pfizer-BioNTech开发的两款上市mRNA疫苗中，LNP脂质组分略有差异。mRNA1273中LNP组分包括SM-102、PEG2000-DMG、DSPC和Cholesterol，而BNT162b2中可电离脂质由ALC-0315替代，PGE-脂质替换成了ALC-0159（PEG-N,N ditetradecylacetamide）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]脂质体在储存和运输过程中容易聚集和降解，影响了COVID-19 mRNA疫苗的效率和安全性。对单个脂质组分进行鉴别和定量检测控制不仅支持工艺和配方开发，也是疫苗生产的关键质量属性，需要在生产和放行阶段严格控制。

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图1NP递送系统二、HPLC-CAD 工作原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]高效液相色谱（HPLC）是药物分析中常用的现代分析技术。由于其高效率、高速度、灵敏度和自动化，被广泛用于药物分析。多种不同的检测器可与HPLC配合使用，以满足不同物质的分析要求，包括紫外检测器（UV）、示差折光检测器（RID）、蒸发光散射检测器（ELSD）、质谱检测器（MS）和脉冲安培检测器（PAD）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]电雾式检测器（CAD），也称带电气溶胶检测器，是过去十年中发展起来的一种新型通用探测器。CAD特性包括与梯度洗脱的兼容性，不依赖于物质的结构特性和电离效率的响应值，以及检测非挥发性和半挥发性物质的能力。

当CAD检测器与HPLC结合使用时，HPLC淋洗液在CAD检测器的雾化室中通过氮气碰撞雾化。含有分析物的较小液滴在室温下干燥形成溶质颗粒。粒子表面通过与带电的氮气碰撞而带正电。具有低负电压的离子阱装置以高迁移速率去除多余的带电氮，具有低迁移速率的带电分析物颗粒将其电荷转移到颗粒收集器。最后，通过高灵敏度的静电检测装置测量分析物的电荷并将其转换为电信号。信号强度与溶质的质量成正比。用于药物分析的液相色谱法和CAD检测已被列入各国药典。由于CAD的高度灵敏性，可以检测更大范围的脂质含量。三、HPLC-CAD用于LNP脂质组分检测的分析方法开发与验证

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]中国食品药品检定研究院联合赛默飞在文章中介绍，他们建立了CAD检测器测定mRNA疫苗中脂质组分含量的方法，并完成了整套的方法学验证及对疫苗样品的测定，结果均表明此方法可靠、准确、可重复、无干扰，适用于mRNA类疫苗中脂质组分的有效控制。

3.1 实验方法

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]这项研究使用了一款mRNA疫苗样品，其LNP组分包括9001（苏州艾博生物）、DMG-PEG2K、DSCP和CHOLE。将mRNA-LNP疫苗稀释后作为检测样品。实验仪器为Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 液相色谱仪，配备Thermo Scientific™ Corona™ Veo™ RS CAD检测器。色谱条件包括：使用C18色谱柱；流动相A：0.01M 乙酸三乙胺水溶液，流动相B：0.01M 乙酸三乙胺甲醇溶液；流速为1.0 mL/min；柱温为55℃；蒸发温度50℃; 进样体积：10μL。梯度洗脱条件见下表：

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3.2 实验结果

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]首先是系统适用性测试。在上述HPLC-CAD检测参数下，9001、DMG-PEG2K、DSCP和CHOLE四种脂质组分成功分离，并获得了针对各个脂质组分的标准曲线（R2均大于0.99）。实验数据符合系统适用性的要求。随后，研究人员测定了该分析方法的准确度、精密度、线性、特异性和适用范围。四种脂质组分的回收率在90%-110%之间，RSD（相对标准偏差）在10%之内。总体精密度是根据不同实验室所有浓度水平的回收率 RSD 计算得出，所有加标样品的RSD均低于 10%，提示该分析方法具有重现性。特异性分析显示该方法不受特定溶剂干扰。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]最后，研究者制定了9001、DMG-PEG2K、DSCP和CHOLE四种脂质组分检测范围，并对5个批次的mRNA疫苗进行了检测，RSD 均小于 10%，回收率均在 80% 至 120% 之间。研究表明该HPLC-CAD分析方法适用于LNP脂质组分的定量检测。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: HPLC-CAD检测脂质组分的方法学开发结果

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物建立了适用的UHPLC-CAD分析方法，4种LNP组分实现基线分离，成功实现脂质组分的鉴别。各脂质组分定量检测线性结果显示，R2均大于0.99。该方法具有很好的重复性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: LNP脂质组分鉴别与检测：耀海平台HPLC-CAD

四、结论

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]新冠疫情的爆发加速了mRNA疫苗技术的产业化，mRNA技术是生物制品的一大突破。与其他传统疫苗相比，mRNA疫苗具有安全性高、体液及细胞免疫双重机制、工艺平台化、研发周期短、低成本等诸多优点。mRNA技术应用场景广阔，预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV，治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等。因此，它们在应对大规模和新出现的流行病方面具有突出的优势。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]然而，mRNA疫苗也存在不稳定、免疫原性高、递送效率低等缺点。在mRNA药物的产业化及临床应用的推动过程中，其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时，需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物质量研究服务平台，目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质；mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA（dsRNA）、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质；LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量，可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测，全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物mRNA质量研究服务详情：耀海生物mRNA药物分析方法开发及样品检测服务

参考文献

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Yu X, Yu C, Wu X, Cui Y, Liu X, Jin Y, Li Y, Wang L. Validation of an HPLC-CAD Method for Determination of Lipid Content in LNP-Encapsulated COVID-19 mRNA Vaccines. Vaccines (Basel). 2023 May 4;11(5):937. doi: 10.3390/vaccines11050937.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] 药品审评中心. 新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）. 2020.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccines–Draft. 2022.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] WHO. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. 2021.

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