【耀文解读】纳米抗体肿瘤成像应用的优劣解析

耀海微生物cdmo

随着肿瘤靶向诊疗技术的发展，目前已发现多种类型的生物分子能够与放射性核素结合发挥靶向作用。其中抗体是一种备受关注的候选分子，主要基于其对肿瘤抗原的高亲和力和高特异性。然而传统的单克隆抗体分子量和体积过大，导致其肿瘤穿透力低、血液清除率低，因而无法全面应用于基于放射性核素的肿瘤成像或治疗。如今，来源于骆驼科动物重链抗体的可变结构域（VHH），也称为纳米抗体（Nbs），逐渐发展为首选的肿瘤靶向分子探针。

2021年4月，马赞达兰医科大学放射学专家Hosseinimehr SJ在Biochim Biophys Acta Rev Cancer [IF: 11.2] 发表综述文章：《Radiolabeled nanobodies for tumor targeting: From bioengineering to imaging and therapy》，文章全面汇总了纳米抗体靶向肿瘤诊疗的先天优势，包括高抗原亲和力、高特异性、高溶解性、高稳定性、高清除率、易生产、易筛选和低免疫原性，有望成为肿瘤成像和治疗领域的重磅品类。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]一、用于肿瘤靶向分子探针的抗体类型

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]根据世界卫生组织（WHO）建议和实体瘤疗效评价标准（RECIST），抗肿瘤药物的疗效需通过治疗过程中肿瘤大小的变化来衡量。发射断层扫描设备SPECT和PET是肿瘤大小评估的解决方案，不仅用于肿瘤的早期诊断，也可用于评估治疗疗效。目前，SPECT和PET操作过程中常用的示踪剂为氟代脱氧葡萄糖（18F-FDG），但18F-FDG肿瘤特异性不强，会受到正常组织的干扰。因此，将放射性核素（成像标签）与靶向性分子探针结合是肿瘤成像的开发方向。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]多种分子能够特异性结合肿瘤细胞，如单克隆抗体、抗体片段、适配体、多肽、小分子配体等。其中单克隆抗体由于其天然的亲和力和特异性，被认为是肿瘤靶向分子探针的候选物质。然而，单克隆抗体分子量约为150 kDa，极大地影响其渗透效率和半衰期，存在健康组织放射性增加的风险。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]因此，分子量较小的合成或天然抗体分子探针似乎更受研究者的青睐，能够改善分子探针的药代动力学。这类抗体衍生物包括抗原结合片段Fab（~50 kDa）、Fab'2（~110 kDa）、微型抗体（~80 kDa）、双特异性抗体（~55 kDa），单链可变片段scFv（~30 kDa）和纳米抗体（~15 kDa）等。其中纳米抗体相比单克隆抗体、抗体片段具备更突出的优势，是SPECT和PET技术下肿瘤靶向分子探针的理想候选物。

图1: 可用于肿瘤靶向分子探针的抗体类型

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]二、纳米抗体作为肿瘤靶向分子探针的优劣势

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体由天然重链抗体（HcAbs）衍生而来。天然重链抗体分子量约为95 kDa，天然存在于骆驼科动物体内，如双峰驼、骆马、单峰骆驼和大羊驼。与两条重链和两条轻链组成的常规IgG抗体相比，HcAb只具有重链，缺乏CH1结构域。但HcAb的抗原结合亲和力并不受抑制。常规IgG抗体中，抗原结合位点包含一个轻链和一个重链可变结构域，而在HcAb中，抗原结合片段仅由一个重链抗体的重链可变域（VHH）组成。VHH区域是抗原结合的最小单位，也成为纳米抗体。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体在肿瘤成像方面具备独特优势，详细如下：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 纳米抗体的优劣势分析

2.1 纳米抗体的优势低分子量

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体的分子量在12~15 kDa之间，是自然存在的最小抗原结合可变结构域。

高穿透力

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体的低分子量、小尺寸有助于其穿透至组织和实体瘤。而且，纳米抗体的序列具有多变性。以上特征允许纳米抗体进入靶向组织，并有效地结合到位于凹表面的表位上，这是常规抗体无法实现的。

高抗原特异性和亲和力

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体存在最小抗原结合区域，保留了常规抗体靶向目标抗原的高特异性和亲和力。纳米抗体包括3个互补决定区（CDR），发挥抗原的特异性和高亲和性。而传统抗体则包含6个CDRs。但纳米抗体CDR3区域更长，提供更大的抗原结合表面，一定程度上弥补了轻链VL缺失造成的抗原结合力下降。

高亲水性和溶解性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体与IgG抗体VH区域的另一个差异在于骨架区FR2。传统单克隆抗体的FR2中，V42、G49、L50和W52这4个氨基酸残基参与VL的相互作用；而在纳米抗体中，4个氨基酸分别突变为F42、E49、R50、G52，由疏水氨基酸突变为亲水氨基酸，提高了纳米抗体的亲水性、溶解度和稳定性。

低聚集性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在IgG抗体及其衍生物中，VH结构域的疏水残基可能会导致分子内聚集。而纳米抗体中疏水残基替换为了亲和性残基，因此导致的聚集效应较低。

高稳定性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体具有pH稳定性、高耐热性和抗蛋白水解特性。多项研究报道，纳米抗体在在多种极端条件下仍保持抗原结合能力，包括极低温（-20℃）、极高温（20℃）、高压、pH值变化和化学变性剂。同时，纳米抗体能够抵抗胃肠道蛋白质水解酶的降解，具有口服给药的潜在应用。

水剂开发特性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]同时，基于纳米抗体在物理化学特殊条件下的高度稳定性，纳米抗体可以配制成长保质期的水剂，储存时间长达数月。

高清除率

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]多种结构特征有利于纳米抗体的快速清除，尤其是通过肾脏途径。例如，纳米抗体不含IgG抗体的可结晶片段（Fc）、小分子量和高度亲水性。纳米抗体用于肿瘤成像示踪剂时，血液中的未结合示踪剂可快速清除。

低免疫原性

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体与人IgG抗体的VH结构域具有高度同源性，有研究人员针对纳米抗体进行了人源化改造，以消除其免疫原性。

变性后重折叠能力

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体一般具备1个或2个二硫键，结构较简单，因此纳米抗体变性后可以重折叠恢复原始构象。

可行的生产工艺

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]由于纳米抗体由单域结构区域的单体组成，单价、多价和双特异性结构的形成同样不涉及复杂的翻译后修饰，因此多种表达系统可用于纳米抗体的生产，包括细菌、酵母等微生物宿主，其生产成本可以有效控制。当前重组疫苗、重组多肽、重组蛋白等生物制品已建立了成熟的工艺，有助于推动纳米抗体的大规模生产。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]此外，纳米抗体与其他蛋白质、药物、毒素、胶束、聚合物或放射性金属的偶联也是可行的。

2.2 纳米抗体的劣势及应对策略

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]与放射性核素偶联，可能会影响纳米抗体的抗原结合活性，这一特征与常规单克隆抗体类似。一般情况下，在抗原结合位点的对侧（通常是C端）定点偶联引入标签，可以避免偶联物提供位阻、影响与抗原表位的相互作用。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]放射性标记的纳米抗体用于成像时，高肾脏摄取会掩盖肾脏周围的病变；而用于治疗时，高剂量的辐射会导致肾毒性。但目前的观点显示，放射性金属标记的纳米体显示出一定程度的肾脏潴留，而放射性卤素标记的纳米体显示出肾脏的加速清除。此外，研究人员尝试了减少肾脏摄取/潴留的其他策略，例如改变标记螯合剂、消除标签，或者联合注射gelofusin（一款基于明胶的血浆容量扩充药）和带正电荷的氨基酸。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]三、小结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]目前，已有2款纳米抗体治疗用药物获批上市，分别为Caplacizumab（Cablivi）和Ozoralizumab。而在肿瘤成像领域，纳米抗体仍处于临床前和临床开发阶段，相关靶点包括：EGFR、HER2、HER3 、HGFR、PSMA、CD-20、CD33、MMR等肿瘤相关抗原。其中进展较快的已启动II期临床试验，如68Ga标记的anti-HER2纳米抗体正在开展两项II期试验，其中NCT03924466的研究目的是评估乳腺癌检测的可重复性，NCT03331601的目的是评估乳腺癌脑转移患者对放射性纳米抗体的摄取。以PD-L1为靶点的纳米抗体[99mTc]-NM-01用于肺癌成像的II期研究也正在开展（NCT04992715）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体生产工艺方面，利用DNA重组技术制备纳米抗体具有成本低、过程可控、批间稳定性高等优势。据耀海经验，纳米抗体在大肠杆菌、酵母中可实现高水平表达，基于微生物表达平台可有效缩短生产周期，降低生产成本。早期的工艺开发方面，纳米抗体打破了传统抗体的平台化工艺。纳米抗体不包含Fc等恒定区域，ProteinA等常规的亲和层析不再适用于纳米抗体的纯化。因此，需针对纳米抗体进行定制化工艺开发。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]相比传统的单克隆抗体药物，纳米抗体在肿瘤成像和疾病治疗领域具备先天的优势。2022年，Market Research Future (MRFR) 的一份综合研究报告预计到 2030 年纳米抗体市场规模将达到 11.4 亿美元，复合年增长率为 24.2%，全球纳米抗体市场有望在未来几年得到迅速扩张。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物擅长有/无标签蛋白的定制化工艺开发。耀海团队全流程贯彻QbD理念，基于DoE高通量筛选发酵、纯化、制剂相关工艺参数或处方，可满足不同品类重组蛋白的表达量、纯度、杂质残留等定制化开发目标，同时高度契合生产放大需求。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海纳米抗体CDMO平台已成功交付多个项目，表达形式涵盖大肠杆菌周质表达、酵母胞外分泌表达等。我们交付的发酵和纯化工艺可满足高纯度、高活性样品的制备，高质量满足临床诊断或治疗需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Piramoon M, Khodadust F, Hosseinimehr SJ. Radiolabeled nanobodies for tumor targeting: From bioengineering to imaging and therapy. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2021 Apr;1875(2):188529. doi: 10.1016/j.bbcan.2021.188529.

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