【菌周刊】汉逊酵母表达系统开发生物制品——乙肝(HBV)疫苗篇

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慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是严重的全球性公共卫生问题，临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状。据世界卫生组织( WHO）统计，全球乙型肝炎表面抗原( hepatitisB surface antigen，HBsAg）阳性率为2.5%，每年所导致的死亡人数超过80万，其中大多数死于肝硬化或肝细胞癌。乙型肝炎是经血液传播的疾病，具体传播途径包括经输血、血液制品、有皮肤黏膜创伤操作和微量血液暴露的密切接触传播、母婴传播及性传播。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]表1:2013-2022年中国乙型肝炎发病人数（单位：万人）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg )，前S1抗原和前S2抗原，而乙型肝炎疫苗由经过特殊处理过的乙型肝炎病毒制成作为抗原，进入人体后可刺激机体生成相应的病毒抗体，这些抗体会在人体内保存相当长的一段时间，使以后侵入的乙肝病毒无法生存和繁殖，从而起到预防乙型肝炎的作用。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]汉逊酵母表达系统是一种利用酵母细胞表达外源蛋白的技术，它是甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安全性好，因此是非常适合开发乙肝疫苗的表达系统。关于汉逊酵母的特性、其表达相关疫苗市场现状等菌菌此前有过相关介绍，详见【菌周刊】多形汉逊酵母表达系统介绍、【菌周刊】汉逊酵母表达系统相关疫苗产业化现状。下面菌菌就为大家详细介绍如何利用汉逊酵母开发出乙肝疫苗。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]一、构建重组酵母

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]获取目的基因：根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因。构建重组质粒：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上构成DNA重组分子。导入宿主细胞：利用细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。培养酵母细胞：短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。检测正确表达目的产物的酵母：筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]二、制备菌种及发酵

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生产过程常温进行，操作温和，将如何防止杂菌污染纳入考虑范围。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡，在发酵液中添加诱导剂如乳糖以诱导可调节启动子的表达。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在碳源中降低葡萄糖浓度、补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6，以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。

三、分离纯化

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，再加入蛋白酶抑制剂防止抗原在细胞破碎时被分解。接着高压匀浆机破碎细胞释放抗原（酵母细胞较大肠杆菌更难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压，通过针型阀突然降压到零使细胞破碎）。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2μm中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量内含物通过滤膜除去，残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去，再用硅胶吸附抗原，热硼酸缓冲液洗脱，再用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以完成二硫键的交联，最后再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上。

四、纯度测定

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛中国药品生物制品检定所疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行纯度分析，可获得良好的分离效果。而对于重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用0.1mol/L DTT（DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇）与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。

五、疫苗保存

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]疫苗的稳定性较差，一般在2-8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。

冻干要点∶（1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。(2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。(3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)](4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的疫苗能保持良好的稳定性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海在汉逊酵母表达重组疫苗方面具有丰富的经验，涵盖菌种改造/构建、菌种建库、工艺开发、方法开发和GMP生产。详情可咨询菌菌：13380332910

参考文献

[1]贾继东.我国慢性乙型肝炎防控所取得的成就与未来挑战[J].中国临床医生杂志,2022,50(10):1135-1136+1130.[2]卞广林. 基于汉逊酵母细胞的新型乙肝表面抗原疫苗的研究[D].复旦大学,2011.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3]胡胜杰. 硅胶-层析联用法纯化汉逊酵母HBsAg与疫苗颗粒完整性研究[D].河北农业大学,2021.DOI:10.27109/d.cnki.ghbnu.2020.000209.

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学习了，谢谢提供分享。