【耀文解读】mRNA技术的新星—自复制RNA(saRNA)技术的回顾与展望

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]导读：诺贝尔奖获得者Drew Weissman博士表示：“saRNA 技术有望成为一种持久的疫苗选择”。2023年11月27日，日本厚生劳动省批准了CSL与Arcturus therapeutics联合开发的一款自复制RNA(saRNA)新冠疫苗：ARCT-154，用于18岁及以上成人初次接种和加强接种。ARCT-154成为全球首款获批上市的自复制RNA疫苗。saRNA疫苗以极低剂量便可触发高效免疫反应，成为下一代RNA疫苗的率先破局者。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]近日，瓦格宁根大学Jerome博士团队在Trends in Biotechnology【IF: 17.3】上发表题为《Rise of the RNA machines – self-amplification in mRNA vaccine design》的综述文章，回顾了自复制RNA(saRNA)的发展历史并对其作出了展望。以这篇文章为契机，菌菌详细梳理了saRNA的发展历程、结构与作用机制、递送系统，并梳理了其潜在的技术变革，为大家呈现一份完整的saRNA技术的回顾与展望。

一、自复制RNA(saRNA)技术的发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]saRNA 是一种合成 RNA，具有在宿主细胞内自我复制的能力，导致靶蛋白表达增加，这一特性使其成为疫苗开发和基因治疗的有前途的工具。该技术的前期发展进程与常规线性mRNA技术一致，包括1961年自体外制备得到mRNA，1990年Wolff在小鼠中递送裸mRNA进而表达出蛋白，以及LNP技术的日益发展与完善，都极大地推动了RNA技术的发展。而真正关于saRNA技术的突破性进展，发生在2012年，Geall等人在PNAS上发表题为“saRNA疫苗的非病毒递送”，自此saRNA技术名声大噪，正式开始了其发展之路。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1 saRNA技术发展历程（图片来源：参考文献[1]）

二、自复制RNA(saRNA)的结构与作用机制

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]saRNA与常规线性mRNA基本组成结构一样，但它可以通过位于5’UTR下游的复制酶进行自我复制。另一个显著区别是saRNA中，位于GOI之前存在甲病毒亚基因组启动子（SGP）区域。SGP通过绕过编码病毒复制酶序列的读取来促进 GOI 转录的启动，促进了仅含有GOI的mRNA拷贝的形成与翻译，这种复制机制可使saRNA所需剂量减少30-1000倍。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2 传统mRNA与saRNA的比较（图片来源：参考文献[2] [3]）

三、自复制RNA(saRNA)递送的发展历程

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]裸RNA对于核酸酶具有高度敏感性且进入宿主细胞的内化能力差，因此疫苗递送载体必不可少。已经开发了几种且较稳定的方式有例病毒样复制子颗粒（VRP）脂质体和LNP。saRNA被病毒结构蛋白包装到VRP中（图3A）。这些颗粒的天然趋向性在结构上与病毒相似，能够有效地将复制子递送至树突状细胞，直接或间接引发抗原呈递细胞的靶细胞，从而诱导强大的免疫应答。但该种递送方式易产生复制感受态病毒（RCV）这一种临床不良污染。VRP 递送的另一个潜在问题是重复应用高免疫原性 VRP 后诱导的抗载体免疫。由于抗体与递送载体结合，抗载体免疫会降低疫苗的效率。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3 saRNA递送的发展进程（图片来源：参考文献[4]）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]除了VRP外，脂质体、液体脂质纳米颗粒（LNP）和固体脂质纳米颗粒（SNP）也是核酸递送的优选方法。它们可提高疫苗稳定性，实现高效的复制子递送，并依赖于不含（哺乳动物）细胞底物的制造工艺。脂质体由带电脂质双层组成，其水核可以捕获DNA和RNA等亲水分子（图3B）。脂质体复合物的表面可以很容易地与聚乙二醇-脂质偶联物或抗体适应，以促进组织特异性疫苗递送。但由于大多数磷脂在暴露于水时会自发自组装，RNA有时会暴露在载体外部，从而影响疫苗的稳定性和毒性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]LNP是一种更灵活的核酸递送平台，它由单层脂质与表面活性剂结合而成（图3C），其不需要亲水内核。1998 年，可电离脂质的实施彻底改变了 LNP 特性，并降低了对早期脂质载体中使用的外部脂质分子的先天免疫原性，且LNP尺寸更好控制。但与脂质体相比，这些新一代 LNP 需要严格控制的制造工艺，首先在低 pH 值下捕获 RNA，同时进行额外的步骤中和脂质电荷以实现有效的体内递送。这些LNP通过受体介导的内吞作用被抗原呈递细胞吸收。随后，内体内的pH值下降导致可电离脂质的质子化，并促进LNP的膜融合和RNA释放到胞质溶胶中。然而，由于PEG类成分递送至细胞有时可以诱导强烈的局部先天免疫反应，因此需要精准的把握剂量。（SNP）、纳米结构脂质载体（NLC）克服了脂质体和LNP的弱点，在稳定性、大规模生产和药物释放中具有优势。

四、自复制RNA(saRNA)技术的创新变革

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]随着saRNA技术发展，一些新的应用和创新进展也随之诞生。多价疫苗是控制和预防病原体传播的有效工具，因为更多的保护性抗原被呈现给免疫系统。在多价saRNA疫苗即单个复制子可以编码多个抗原，或者将每个表达不同抗原的多个复制子混合在一个疫苗制剂中，多价saRNA疫苗已显示出对季节性流感病毒株以及拉沙病毒和埃博拉病毒混合的保护作用。尽管多价复制子疫苗可以快速开发和配制，但优化单个靶抗原的比例组成很费力，并且需要进行大量测试，尤其在观察到对病毒的不同病毒分离株的交叉反应并且抗体依赖性增强导致接种疫苗的个体产生不良反应时。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]由于大多数病毒病原体通过呼吸道、胃肠道或泌尿生殖道等粘膜表面进入宿主，因此黏膜组织中的局部免疫应答对于预防多种病原体非常重要。但目前mRNA疫苗主要通过直接肌肉注射给药，主要侧重于全身细胞和体液免疫，而没有给予足够的黏膜免疫。过去，粘膜递送主要用于减毒活疫苗，可以通过非侵入性方法实现大规模给药。然而，减毒活疫苗存在毒力恢复的相关风险，以及缺乏明确的粘膜佐剂，阻碍了对粘膜给药途径的发展。如今，随着RNA疫苗脂质体制剂和LNP封装的发展，以及这些分子被粘膜组织吸收的倾向，为saRNA的应用创造了新的机会。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]taRNA是saRNA的一种特殊形式，需要至少两种不同的mRNA，一种用于编码复制酶，另一种编码目标蛋白，疫苗的安全性得以提高。saRNA片段小型化也是一种发展方向。目前使用最广泛的甲病毒复制酶，长度有 8-9 kb，对疫苗的递送、剂量和成本都带来极大的限制。作者认为RNA 依赖性RNA 聚合酶 （RdRp）与复制子 RNA 末端的基本 5' 和 3' 非编码区相结合就足以进行自扩增。RdRps大小仅为~2 kb，是潜在的小型化复制酶。

五、结论

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]saRNA由于其复制特性，仅需约1/6线性mRNA剂量的疫苗即可达到相同的蛋白表达，剂量的优势可以显著降低其生产成本以及由剂量带来的免疫原性，是理想的疫苗递送平台。目前，saRNA疫苗已可用于传染性疾病、细菌病原体、寄生虫以及癌症的临床研究治疗，应用前景广泛。但其也有诸多限制因素，如复制酶的高长度严重限制了GOI的长度，进而限制了saRNA的广泛应用；源于病毒的结构蛋白本身具有高度免疫原性，为疫苗的申报与注册带来了挑战；同时saRNA疫苗与循环病毒的重组可能性，进一步提高了潜在的安全风险。我们期待saRNA技术可以克服诸多挑战，成为mRNA技术的后起新秀。

参考文献

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Blakney AK, Ip S, Geall AJ. An Update on Self-Amplifying mRNA Vaccine Development. Vaccines (Basel). 2021 Jan 28;9(2):97.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] Dolgin E. How COVID unlocked the power of RNA vaccines. Nature. 2021 Jan;589(7841):189-191.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][3] Schmidt C, Schnierle BS. Self-Amplifying RNA Vaccine Candidates: Alternative Platforms for mRNA Vaccine Development. Pathogens. 2023 Jan 13;12(1):138.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][4] Comes JDG, Pijlman GP, Hick TAH. Rise of the RNA machines - self-amplification in mRNA vaccine design. Trends Biotechnol. 2023 Nov;41(11):1417-1429.

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