小分子化合物在新药筛选和新适应症发现等研究中的应用 - MedChemExpress

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药物开发周期漫长，成本高昂，大体分为前期药物开发、临床前研究、临床研究、批准上市等几个环节。前期药物开发是新药开发中的关键步骤，包括对疾病机制的研究、靶点发现及确认、苗头 (先导) 化合物的发现等[1]。
高通量筛选技术 (High-Throughput Screening, HTS) 是药物设计中常用技术之一，用于从化合物库中发现可能成为药物化学优化的先导化合物，大大加快了大批量化合物筛选的进程。HTS 利用自动化快速测试数千至数百万个样品，可在模型生物、细胞、或分子水平上验证生物活性，筛选已知结构的小分子化合物、化学混合物、天然产物、寡核苷酸和抗体等等[2][3]。

图 1. 药物发现过程中涉及的步骤[4]。

小白：小M，我对 HTS 很感兴趣，但是我看 MCE 有很多化合物库，我该怎样选择呀？
  小 M：如有明确的靶点，通路，疾病的话，推荐选择相应的实体化合物库；若有明确通路相关的具体蛋白名称和结构的话，可考虑使用虚拟筛选 (Virtual Screening) 进行初步筛选，再根据虚拟筛选的所得结果，购买对应的实体化合物。
小白：听起来有点复杂？
小 M：No no no，其实并不复杂，实验目的明确，可迅速找到合适的化合物库，我们也可以帮您进行筛选匹配出您需要的化合物，根据您的实验，所需量，所需浓度定制您的专属化合库~

图 2. 定制化合库的信息。

小 M: 基于化合物库的筛选，主要包括实验设计，药物筛选，数据分析，先导化合物确认等过程。
▐  Step1 | 关于筛选方法
如图 3 所示，HTS 实验筛选有很多方法，包括细胞实验、生化实验、以及体内简单生物体（斑马鱼等）的实验等。
较为常用的是基于细胞的筛选，此方法可以提供无法从生化测定中获得的数据，例如化合物在特定受体或细胞内靶点上是否存在药理活性。因此，基于细胞的筛选特别有希望成为研究细胞生长和分化、检查小分子和细胞生长条件对细胞功能和生理学的影响以及了解哺乳动物细胞信号通路的重要工具[3]。

图 3. HTS 方法的一般分类[4]。

▐  Step 2 | 基于细胞实验的筛选流程

• 初筛
  

其中细胞活力/增殖是常用的方法之一，初筛建议先采用单一浓度进行筛选。
常用的是 10 μM 进行筛选 (如果细胞可以耐受较高的 DMSO 含量，初筛使用浓度也可以增加到 30 μM/50 μM; 注意做好 DMSO 溶剂对照!) ，对比抑制率/激活率或者根据化合物筛选的活性数据及数量筛选出阳性化合物。注意：初筛使用的化合物浓度越低，筛选出的化合物越少，相对活性越高。

• 复筛
  

将初筛获得的阳性化合物设置不同浓度梯度进行复筛。建议设置 6-7 个浓度，稀释范围尽量高于四个数量级，最高浓度设置可以参考 DMSO 耐受测试数据，一般不超过 100 μM，每种浓度至少设置 3 个重复。
通过复筛结果，排除假阳性化合物及无浓度依赖关系化合物，选择出最佳活性化合物。

• 先导/苗头化合物验证
  

由于每种检测方法都存在一定的限制，所以对于初筛或复筛得到的苗头化合物，还需要通过采用与初筛和复筛不同的检测方法做进一步验证分析，以排除假阳性。
注意：实验要设置阴性对照，阳性对照（如有）及空白对照等。

图 4. 基于细胞的 HTS 流程。

接下来，小 M 给大家举 2 个客户验证的高分栗子！

文献来源：Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.
IF=37.8
在本篇文章中，客户利用小分子激酶抑制剂库 (HY-L009) 和用于 CaMKII-δ9 (人类心脏中最丰富的 CaMKIl-δ 剪接变体) 激酶活性测定的高通量系统来筛选出并验证了具有高活性和选择性的 CaMKIl-δ 小分子抑制剂 -- Hesperadin，是作为具有心脏保护和抗肿瘤活性双重功能的先导化合物。

图 5. CaMKIl-δ 抑制剂的筛选流程[5]。

A: 高通量筛选流程; B: 4160 种化合物对 CaMKII-δ9 激酶活性的抑制率; C: 复筛中抑制 CaMKII-δ9 激酶活性的 IC50 最低的前 10 个化合物的列表。

初筛：首先利用 CaMKII-δ9 重组蛋白建立了一个筛选系统，测试了包含 4160 个化合物的抑制剂库 (部分购自 MCE) 的抑制作用，以 KN93 作为阳性对照 (图 5A 和 5B)。在 10 μM 浓度下，33 个分子抑制 CaMKII-δ9 的活性超过 95%。
复筛：测试初筛获得的 33 个分子抑制 CaMKII-δ9 激酶活性的 IC50。
苗头化合物的验证： 在复筛的基础上，选择 IC50 最低的前 10 个化合物 (图 5C)，进一步分析对心肌细胞的保护作用。
最后作者团队在体外筛到具有抗肿瘤活性的 Aurora B 激酶抑制剂 Hesperadin，能够以 ATP 竞争的方式特异性的抑制心脏中 CaMKII-δ。此外，在体内移植了人类癌细胞的 BALB/c 裸鼠模型中，Hesperadin 延缓了肿瘤的生长，但没有引起心肌细胞死亡或心脏损伤 (图 6)。

图 6. 抗肿瘤活性的 Aurora B 激酶抑制剂 Hesperadin 的实验验证[5]。

A: Hesperadin 对 CaMKII 亚型的 IC50 值及激酶选择性; B: Hesperadin 显著降低 I/R 诱导的心肌梗死面积; C: Hesperadin 显著抑制肿瘤生长; D: Hesperadin 在心脏和肿瘤中的双重功能。

文献来源：Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.
IF=28.2
抑癌基因 TP53 的突变体 Y107H 可增加小鼠的患癌风险，作者通过 MCE 抗癌症化合物库  (HY-L025)，从2000多个化合物中经过初筛和复筛 2 次筛选，得到诱导 Y107H 突变的 HCT116 结直肠癌细胞（克隆 A11 和 C2）优先丧失活力的化合物，并探究 Y107H 在结肠癌中作用的潜在机制。

图 7. 增强 Y107H 突变的结直肠癌细胞活力丧失的化合物筛选的示意图[6]。

候选化合物的验证：在筛选得到的化合物中，其中有两个化合物是谷氨酰胺酶抑制剂 CB-839 和 BPTES，使用独立细胞活力测定 (Alamar Blue）证实了两个候选化合物处理细胞后，Y107H 突变的结直肠癌细胞的敏感性增加 (图 8A 和 8B)。选取 CB-839 进行体内验证实验，CB-839 (200 mg/kg) 可以显著抑制 NSG 小鼠 (移植 Y107H 细胞组) 体内肿瘤的生长。

图 8. CB-839 在 Y107H 突变结直肠癌细胞和小鼠体内的验证[6]。

A-B：CB-839或 BPTES处理Y107H 突变的结直肠癌细胞 72 小时的 IC50 分析；C-D：CB-839 对有 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 的 NSG 小鼠中肿瘤生长的影响。

得到了先导化合物，也可以对结构做进一步优化以促进药物更好的发挥作用。整个实验做完，下一步就可以整理数据补充到你待发表的文章了！高分在向你招手呢.

参考文献：
[1] J P Hughes, et al. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar;162(6):1239-49.
  
[2] Michael Entzeroth, et al. Overview of high-throughput screening. Curr Protoc Pharmacol. 2009 Mar;Chapter 9:Unit 9.4.

[3] Paweł Szymański, Magdalena Markowicz, et al. Adaptation of High-Throughput Screening in Drug Discovery-Toxicological Screening Tests. Int J Mol Sci. 2012; 13(1): 427–452.

[4] Hasan Aldewachi, et al. High-Throughput Screening Platforms in the Discovery of Novel Drugs for Neurodegenerative Diseases. Bioengineering (Basel). 2021 Feb 23;8(2):30.

[5] Junxia Zhang, et al. Novel CaMKII-δ Inhibitor Hesperadin Exerts Dual Functions to Ameliorate Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury and Inhibit Tumor Growth. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.

[6] Alexandra Indeglia, Jessica C Leung, et al. An African-Specific Variant of TP53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression. Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.

[7] Steven M Corsello, et al. The Drug Repurposing Hub: a next-generation drug library and information resource. Nat Med. 2017 Apr 7;23(4):405-408.

[8] Brice A P Wilson, et al. Creating and screening natural product libraries. Nat Prod Rep. 2020 Jul 1;37(7):893-918.

[9] Liu-Xia Zhang, et al. TCMSID: a simplified integrated database for drug discovery from traditional chinese medicine. J Cheminform. 2022 Dec 31;14(1):89.

[10] Qingxin Li, et al. Application of Fragment-Based Drug Discovery to Versatile Targets. Front Mol Biosci. 2020 Aug 5;7:180.

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学习了，谢谢提供分享。