深思熟“滤” | AAV病毒澄清过滤的应用分享

BLA小助手

作者：乐纯生物（BLA联合发起单位）

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一类单链线状 DNA 缺陷型病毒，作为体内新型治疗领域的明星载体之一，对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力，目前已受到越来越多生物药企业和研发机构的青睐。

AAV 病毒的规模化生产通常需要经过以下步骤：

细胞复苏→细胞培养→质粒转染→病毒收获→病毒纯化→无菌分装。

GMP级病毒的规模化生产工艺

AAV 培养过程中大多是胞内分泌，需要进行细胞裂解和酶处理，因此获得的料液是相对混浊的溶液，其中包括AAV颗粒以及与工艺相关的杂质，如：DNA 、蛋白质、培养基成分和细胞碎片。相关杂质的去除通常通过离心或过滤来进行。然离心存在无菌操作困难、放大困难、降浊效果有限等问题，通常搭配采用澄清过滤的方式，解决其放大困难和污染风险，用以最终达到降浊的效果。

AAV 澄清工艺作为上下游工艺衔接的重要步骤，可去除细胞碎片等颗粒较大的杂质，提高层析填料的使用寿命，并降低对层析介质所需严格清洗方案的要求，用来减小下游纯化的压力。

市面上存在多种过滤器选择，但在生物制药行业(包括AAV 生产)主要使用深层过滤器进行澄清工艺。深层过滤的机理主要包括：

■ 表面/机械拦截

■ 深度拦截

■ 静电吸附

深层滤器通过纤维素和无机填料搭配正电荷树脂捕获与之电性相反的杂质和较大尺寸的颗粒。

由于细胞裂解液核酸碎片和细胞碎片多，会使料液粘度高，这对深层过滤是个挑战。此外，病毒类载体在常规的收获环境中带负电，更容易被带有正电的过滤介质吸附，从而导致收率损失。因此，在 AAV 的澄清工艺中，过滤材质吸附和材质孔径范围是两个选择深层过滤器的主要考量因素。

深层过滤机理

案例分享：

本次案例采用初始细胞密度分别为 9*106cell/mL 和5.7*106cell/mL HEK293 细胞收获液，初始细胞活率为 80%-90%。

深层过滤操作连接示意

我们采用乐纯生物 LeClafine C1C1型深层过滤器进行澄清过滤，将进液流速控制为150-180LMH 进行恒流过滤，终点压力控制在 1bar，滤出液混合浊度控制在 30NTU 以内，对料液进行过滤，载量和料液回收率的数据如下表所示。

结论说明：C1C1 型号深层过滤器针对 AAV 病毒有较好的载量和高病毒回收率表现。通过优化的AAV收获工艺，深层过滤器处理量可达到200 L/m2，收率可达90%，从而使工艺更易于放大到生产规模。

乐纯生物LeClafine 系列深层过滤器具有显著的澄清效果、高蛋白回收率、高载量、低溶出和低内毒素水平等特点，产品系列覆盖从小试到中试再到商业化的放大需求，为客户提供一系列过滤、净化技术，满足客户各种规模的生物制药上有和下游程序步骤。

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关于乐纯生物

上海乐纯生物技术股份有限公司成立于2011年，以外延式增长路径并入格氏流体、康晟生物、斯坦利思等优秀品牌，目前业务范围覆盖细胞培养、过滤纯化、一次性使用系统、工业级防污染洁净方案等多个应用场景，现已成为广受业内认可的医药行业上游工艺全链条头部供应商。
使命愿景：以技术创新为驱动，提供高品质的生物工艺解决方案，致力于成为全球生物制药企业最信赖的合作伙伴。

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