请教大家，ELISA实验封闭效果

沉迷吃鸡

各位大佬：
       我这边在做一个ELISA的方法开发，基本流程是高吸附板+包被抗原+封闭+洗板+加抗体+洗板+二抗+洗板+TMB+终止，发现封闭效果不好（包被抗原和不包抗原（相同封闭条件），不同浓度梯度样品的响应值是差不多的），后面考察了5%脱脂奶粉，1%BSA、3%BSA、20%脱脂奶粉，血清，商品化封闭液，加吐温，结果是脱脂奶粉+吐温有一点效果，但是也没有办法完全封闭住。
备注：1、换过不同厂家的脱脂奶粉、BSA、二抗
2、高吸附板子是康宁的9018，咨询过厂家是适用于我们产品的分子量
3、封闭条件：试过37℃2h，37℃4h，室温2h，室温4h，37℃2h震荡，室温2h震荡
4、样品缓冲液无结合
5、样品浓度从几毫克做到几微克，基本到几十微克的时候吸收值在0.05以下，但是因为产品问题，抗体跟抗原结合比较弱，用几十微克浓度的抗体，跟抗原结合做不出上平台；抗原浓度做到很高了··再高就要1支抗原铺一个96孔板····
问题：
1、大家有没有其他封闭效果好的方法
2、除了高吸附板+不包被+封闭+抗体+二抗，还有没有别的方法可以确认封闭效果（个人认为抗原也算封闭的一部分，不加抗原的封闭效果肯定不如加了抗原的）
3、结合实验的ELISA的曲线上平台一定要有三个点嘛？有弯曲趋势可以嘛？

yhgz

路过顶一下！

机智鼠

回复：

针对您在ELISA方法开发中遇到的封闭效果不佳的问题，以下是一些建议和可能的解决方法：

1. **优化封闭条件**：虽然您已经尝试了多种封闭液和条件，但还可以考虑使用不同浓度的封闭液、不同的封闭时间以及温度。例如，可以尝试使用0.5% BSA+0.5% Tween-20的封闭液，或者使用商业封闭缓冲液如SuperBlock（Pierce）。此外，封闭时间可以延长至过夜，温度可以选择室温或37°C。

2. **改变包被方式**：除了高吸附板外，还可以尝试使用其他类型的板子，如普通酶标板或化学修饰过的板子。同时，可以尝试使用不同的包被浓度和时间，以找到最佳的包被条件。

3. **优化洗涤条件**：洗涤步骤对于去除未结合的抗体和二抗非常重要。可以尝试增加洗涤次数、延长洗涤时间或使用更强的洗涤缓冲液（如含有更高浓度的Tween-20）。

4. **调整抗体浓度和稀释度**：如果样品浓度过高导致非特异性结合增加，可以尝试降低抗体浓度或增加稀释度。同时，可以使用亲和力纯化的抗体来提高特异性。

5. **使用阻断剂**：在加入一抗之前，可以在板上加入一种能够与非特异性位点结合的阻断剂（如无关蛋白或多肽），以减少非特异性结合。

6. **采用竞争法或间接法**：如果直接法无法得到满意的结果，可以考虑采用竞争法或间接法进行检测。这些方法可以减少非特异性结合的影响。

7. **参考相关法规和指南**：在进行ELISA实验时，建议参考相关的法规和指南，如《中国药典》中的生物制品检测方法和质量控制标准等，以确保实验的准确性和可靠性。

希望以上建议能对您有所帮助！如有需要进一步的帮助或有其他问题，请随时联系我。

【鼠鼠还在学习中，内容仅供参考（药搭GMP软件提供技术支持）】

张寅

换过板子么？我们有碰到过，即使是同样货号的板子，made in china 和 made in USA ，做出来的效果都差别很大。

沉迷吃鸡

机智鼠 发表于 2025-2-13 08:47
回复：

针对您在ELISA方法开发中遇到的封闭效果不佳的问题，以下是一些建议和可能的解决方法：

果然不亏是机智鼠！！！！

沉迷吃鸡

张寅 发表于 2025-2-13 11:22
换过板子么？我们有碰到过，即使是同样货号的板子，made in china 和 made in USA ，做出来的效果都差别很 ...

换过SA的板子，试过生物素-亲和素的搭配固定受体，但是结果还是不好···我再试试其他板子，谢谢老师

沉迷吃鸡

补充，最近又试了BSA+奶粉，BSA+明胶、奶粉+明胶混合封闭，效果都不如奶粉好····