求外泌体提取与纯化方法~

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有大佬归纳总结下，外泌体提取纯化方法大盘点吗？现在市场工业生产应用最多的提取纯化方法那种呀？我做无血清培养基的，回答的好，可给大佬安排一下γδT的试用，2.2L，性能85保底，一般90以上，细胞数量70亿，或者培养基自带类囊泡物质控制在10E7的无血清干细胞培养基体验装。

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安好v16

一、常用外泌体提取方法
超速离心法（Ultracentrifugation, UC）

步骤：

预处理：低速离心（300-2000×g）去除细胞及碎片。

高速离心（10,000-20,000×g）去除大囊泡和细胞器。

超速离心（100,000-200,000×g，1-2小时）沉淀外泌体。

优点：无需额外试剂，适用多种样本。

缺点：设备昂贵，耗时，可能损伤外泌体结构，纯度较低（需结合其他纯化方法）。

密度梯度离心

原理：利用蔗糖或碘克沙醇梯度分离不同密度的颗粒。

步骤：样本铺于梯度介质上，超速离心后外泌体位于1.13-1.19 g/mL层。

优点：纯度较高。

缺点：操作复杂，耗时，需优化梯度。

聚合物沉淀法（如PEG）

步骤：样本与PEG溶液混合，低温孵育后离心（1500-10,000×g）沉淀外泌体。

优点：操作简单，适合低浓度样本。

缺点：杂质多（共沉淀蛋白质），需进一步纯化。

超滤法

原理：利用不同孔径滤膜（如100-200 kDa）截留外泌体。

优点：快速，保持外泌体活性。

缺点：膜易堵塞，纯度有限。

免疫亲和捕获法

步骤：抗体（如抗CD63、CD9）偶联磁珠，特异性结合外泌体后洗脱。

优点：特异性高。

缺点：成本高，依赖抗体质量，仅捕获特定亚群。

尺寸排阻色谱（SEC）

原理：基于粒径分离，外泌体在色谱柱中后洗脱。

优点：高纯度，保留完整性。

缺点：样本量受限，需优化流速。

二、纯化与验证
纯化步骤

洗涤：PBS重悬后再次超速离心去除杂质。

联合使用：如超速离心后结合密度梯度离心或SEC提高纯度。

验证方法

形态：透射电镜（TEM）观察典型杯状结构。

标志蛋白：Western blot检测CD9、CD63、TSG101等。

粒径分析：纳米粒子追踪分析（NTA）或动态光散射（DLS）。

浓度测定：BCA法或外泌体专用试剂盒。

三、方法选择建议
高纯度需求：超速离心+密度梯度离心/SEC。

快速提取：PEG沉淀或超滤法（适合诊断筛查）。

特异性需求：免疫亲和法（需明确靶标）。

样本类型：血液需去除血小板，尿液需浓缩，细胞上清需预处理。

四、注意事项
样本处理：避免反复冻融，提取后-80℃保存。

污染控制：去除脂蛋白（血清样本）和凋亡小体。

下游应用：功能研究需确保外泌体活性，避免剧烈离心。

Ovo？

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