自己翻译的 USP chemical tests/401 fats and fixed oils

宝丽金

网上搜了，没有人上传这章的翻译，就自己翻了。
检测项目的前后顺序略有改变，用得着的就看看吧，欢迎指正错误之处。

401 脂肪和不挥发油

下述定义和通用步骤适用于脂肪、不挥发油、蜡、树脂、香脂和相似的物质。

样品制备

如果所取油试样因为硬脂酸甘油酯而显浑浊，则将其放置在一个容器中并置50摄氏度的水浴中加热直至液体变澄清。于保温漏斗中，用干燥滤纸过滤。将滤液混合彻底，根据测试项目的需要，一次性称取对应份数的样品于不同的、含有移液滴管或称重滴定管的瓶中。整个操作过程中，应保证油试样处于融化状态，直至取样结束。

检测项目

比重

按841的方法测比重。

熔解温度

按741的方法测溶解温度。

酸值（游离脂肪酸）

在本药典中，脂肪和不挥发油的酸度可以用中和10g油试样中游离酸所耗0.1N浓度的碱的毫升数来表示。通常情况下，酸度也叫做酸值，是中和1.0g油试样中游离酸所消耗的氢氧化钾的毫克数。除非所测药品的单章里面有规定，否则一般按下述方法进行测定。

方法：精确称定10.0g油样品，将其溶解于含有25ml乙醇和25ml乙醚混合溶液的烧瓶中（该混合溶液在使用之前已用0.1N浓度的氢氧化钾或氢氧化钠溶液中和至对酚酞显中性）。如果样品不溶于冷的溶剂中，则在烧瓶上安装一个合适的冷凝器，缓缓加热并不时振摇，直至样品溶解。往样品样中加1ml酚酞试液，用0.1N浓度的氢氧化钾滴定液或0.1N浓度的氢氧化钠滴定液进行滴定，滴定至将溶液振摇30秒其仍显淡粉色为止。

计算酸值或者中和10.0g油样品中游离脂肪酸所消耗的0.1N浓度的碱的毫升数。按如下公式计算酸值：

56.11V×N/W

其中，56.11是氢氧化钾的分子量，V是毫升数，N是碱液的当量浓度，W是所取样品的重量。

如果滴定消耗的0.1N浓度的氢氧化钾滴定液或0.1N浓度的氢氧化钠滴定液不足2ml，则应该适当的稀释该滴定液，或者增大样品量。

如果样品保存是通过充满二氧化碳进行的，则在滴定前先轻微的回流乙醇-乙醚混合溶液10分钟。

酯化值

酯化值是指皂化1.0g油试样中酯消耗的氢氧化钾毫克数。如果皂化值和酸值都已确定，则酯化值等于皂化值减去酸值。

方法：称取1.5~2.0g油样品于去皮的250ml烧瓶中，加入20~30ml已中和的乙醇，摇匀。往溶液中加入1ml酚酞试液，用0.5N浓度的氢氧化钾乙醇滴定液滴定，直至游离酸被中和完全。加入25.0ml，0.5N浓度的氢氧化钾乙醇滴定液，安装合适的冷凝器后，在蒸气浴上加热回流30分钟，回流过程中需频繁旋摇烧瓶（回流时间也可根据酯类的不同延长至90分钟，来保证皂化完全）。按如下公式计算皂化值：

[56.11(VB-VT)N]/W

其中，56.11是氢氧化钾的分子量；VB是空白试验消耗的0.5N浓度盐酸的毫升数，VT是实际试验中消耗的0.5N浓度的盐酸的毫升数；N是盐酸真实当量浓度；W是所取样品的克数。

皂化值

皂化值是指中和 1.0g油试样中游离酸并皂化其中酯类所消耗的氢氧化钾毫克数。

方法：称取1.5~2.0g油样品于去皮的250ml烧瓶中，加入0.5N浓度的氢氧化钾乙醇溶液25.0ml。安装合适的冷凝器后，在蒸气浴上加热回流30分钟，回流过程中需频繁旋摇烧瓶（回流时间也可根据酯类的不同延长至90分钟，来保证皂化完全）。往溶液中加入1ml酚酞试液，并用0.5N浓度的盐酸滴定液滴定过剩的氢氧化钾。在同样条件下进行空白试验。

按如下公式计算皂化值：

[56.11(VB-VT)N]/W

其中，56.11是氢氧化钾的分子量；VB是空白试验消耗的0.5N浓度盐酸的毫升数，VT是实际试验中消耗的0.5N浓度的盐酸的毫升数；N是盐酸真实当量浓度；W是所取样品的克数。

不皂化物

方法：精确称取5.0g油试样于250ml的锥形瓶中，加入50ml由12g氢氧化钾溶于10ml水并加乙醇稀释至100ml的溶液，将锥形瓶安装合适的回流装置后，将其置于蒸气浴上回流1小时，回流过程中需频繁旋摇锥形瓶。回流后，将溶液冷却至25℃以下后，将其转移至一个配有聚四氟乙烯旋塞阀的分离器中，用两份50ml水冲洗锥形瓶并将洗液合并至分离器中（旋塞阀不能涂抹润滑剂）。用3份各100ml的乙醚萃取溶液，将萃取液合并至另外一个含有40ml水的分离器中。轻轻地转动并振摇分离器数分钟（注意：如果震荡过于猛烈会生成难以分离的乳状液）。将混合液静置分层，去掉底层水相，用两份各40ml的水洗乙醚层，静置分层后，去掉水层。然后对乙醚层用40ml氢氧化钾溶液（3 in 100）洗涤，再用40ml的水洗涤，并将这两种洗涤按次序重复三次。用数份40ml的水洗涤乙醚层，直至往分离的水层中滴加2滴酚酞试液不再显红色为止。将乙醚层转移至去皮的烧瓶中，用10ml乙醚冲洗分离器并将洗液合并至烧瓶中。在蒸气浴中加热使乙醚蒸发，并往烧瓶残渣中加入6ml丙酮。通气使丙酮被带走除掉，然后在105℃将残渣干燥，直至连续称量差异不大于1mg。按如下公式计算样品中不皂化物的百分比：

100（WR/WS）

其中，WR是残渣重量的克数；WS是样品重量的克数。

注意：将残差溶于已事先中和至对酚酞显中性的20ml乙醇中，加入酚酞试液，用0.1N浓度的氢氧化钠乙醇滴定液滴定至首次出现淡粉红色并且能持续30秒。如果所消耗的0.1N浓度氢氧化钠乙醇滴定液多于0.2ml，则说明分离过程不完全，称量所得的残渣重量不能视为不皂化物，试验应该重新进行。

羟基值

羟基值是等同于1.0g油样品中羟基含量的氢氧化钾毫克数。

“吡啶-醋酸酐”试剂：在使用之前配制，将3当量新开或新蒸馏的吡啶与1当量的新开或新蒸馏的醋酸酐混合。

方法：根据下表对应关系，称取一定量的样品于250ml的具玻璃塞锥形瓶中，加入5.0ml吡啶-醋酸酐试剂。向另一个250ml的具玻璃塞锥形瓶中加入5.0ml吡啶-醋酸酐试剂，作为空白对照。将两个烧瓶分别安装上合适的玻璃接口的回流冷凝装置，在蒸气浴上加热1小时后，通过冷凝管分别加入10ml水，然后再继续蒸气浴10分钟。将烧瓶冷却，同时配制0.5N浓度的用氢氧化钾乙醇溶液中和至对酚酞显中性的丁醇，然后各自通过冷凝器加入15ml该丁醇，然后移去冷凝器，再分别用10ml该丁醇洗涤各烧瓶的内壁。向两个烧瓶中各自加入1ml酚酞试液，用0.5N浓度的氢氧化钾乙醇滴定液滴定，记录所消耗的氢氧化钾乙醇滴定液的毫升数，试液中消耗的记为T，空白对照中消耗的记为B。向125ml的锥形瓶中加入10g油样品，并加入10ml新蒸馏的并已事先中和至对酚酞显中性的吡啶，混合均匀，加入1ml酚酞试液，用0.5N浓度的氢氧化钾乙醇滴定液滴定，记录样品中游离酸消耗的氢氧化钾乙醇滴定液毫升数为A。按如下公式计算羟基值：

(56.11N/W)[B+(WA/C)-T]

其中，W是用于乙酰化的样品克数，C是用于游离酸测定的样品克数，N是氢氧化钾乙醇滴定液的真实当量浓度，56.11是强氧化钾的分子量。如果样品酸值已知，可用如下公式计算羟基值：

(56.11N/W)[B-T]+AcidValue

其中，W是用于乙酰化的样品克数，N是氢氧化钾乙醇溶液的当量浓度，56.11是氢氧化钾的分子量。

羟基值大概范围	参考样品用量/克数
0-20	10
20-50	5
50-100	3
100-150	2
150-200	1.5
200-250	1.25
250-300	1.0
300-350	0.75

碘值

碘值是指100g油样品在规定条件下吸收的碘单质克数。

方法：参考下表精确称取一定量的油样品于250ml的碘瓶中，加10ml氯仿使溶解，加入25.0ml溴化碘试液，塞紧塞子，避光放置30分钟，放置过程中偶尔振摇几次。然后顺次加入30ml碘化钾试液，100ml水，然后用0.1N浓度的硫代硫酸钠滴定液滴定离析的碘，每滴加一滴滴定液都要彻底振摇溶液。当碘的棕色变得很淡的时候，往溶液加3ml淀粉试液，继续用0.1N浓度的硫代硫酸钠滴定液滴定至蓝色消失。同时在相同条件下做空白对照。按照下式计算碘值：

[126.90(VB-VS)N]/(10W)

其中，126.90是碘的原子量，VB是空白对照中消耗的0.1N浓度的硫代硫酸钠滴定液的毫升数，VS是检测溶液中消耗的0.1N浓度的硫代硫酸钠滴定液的毫升数，N是硫代硫酸钠滴定液的实际当量浓度，W是所用样品的克数。

预估碘值	建议样品用量  ±0.1
<5	3.0
2-20	1.0
21-50	0.4
51-100	0.2
101-150	0.13
151-200	0.1

过氧化值

过氧化值是指1000g油样品所含的过氧化物，用活性氧的毫当量来表示。（注意：这项测试应在取样后迅速进行，以免油样品被氧化。）

方法：精确称取约5g样品，置于250ml的具毛玻璃塞锥形瓶中，加入30ml冰醋酸和氯仿的混合物（3:2），振摇使样品溶解，然后加入0.5ml饱和碘化钾溶液。振摇1分钟，再加入30ml水。用0.01N浓度的硫代硫酸钠滴定液滴定，滴加滴定液过程需缓慢并持续振摇，直至溶液黄色快要消失为止。加入5ml淀粉试液，继续滴定并猛烈振摇，直至蓝色消失。同时按相同条件作空白对照。需注意，空白对照中使用的滴定液应不超过0.1ml。按下式计算过氧化值：

[1000(VT-VB)N]/W

其中，VT 是检测溶液中消耗的0.01N硫代硫酸钠滴定液的毫升数，VB 对照溶液中消耗的0.01N硫代硫酸钠滴定液的毫升数，N是硫代硫酸钠滴定液的当量浓度，W是样品克数。

茴香胺值

试液A：将0.500g油样品溶于异辛烷中，并稀释至25.0ml。

试液B：往5.0ml试液A中加入1.0ml，2.5g/L的对氨基苯甲醚冰醋酸溶液，振摇，避光保存。

标准溶液：往5.0ml异辛烷中加入1.0ml，2.5g/L的对氨基苯甲醚冰醋酸溶液，振摇，避光保存。放至刚好10分钟后使用。

方法：测定试液A在350nm的吸收度，以异辛烷作空白补偿。测定试液B在350nm的吸收度，以标准溶液做补偿。按下式计算茴香胺值：

25(1.2AS-AB)/m

其中，AS是试液B在350nm波长的吸收度，AB是试液A在350nm波长的吸收度，m是样品的重量克数。

总氧化值

总氧化值由如下公式计算：

2PV+AV

其中，PV是过氧化值，AV是茴香胺值。

脂肪酸凝固点

脂肪酸制备：取75ml甘油-氢氧化钾溶液（25g氢氧化钾溶于100ml甘油制备而来）于800ml的烧杯中，加热至150℃，加入50ml澄清的脂肪，如果是固体，要先将其融化。继续加热烧杯中混合物15分钟并频繁搅拌，保持温度不超过150℃。当烧杯中混合物变得均匀，溶液顶端凹液面没有颗粒物附着于烧杯壁时说明皂化完全。皂化完全后，将烧杯中混合物导入含有500ml近乎沸腾的水的800ml的烧杯或有柄蒸发皿中，缓缓加入50ml稀硫酸（水/硫酸：3/1），加热溶液并频繁搅拌，直至脂肪酸层变得澄清透明。用沸水洗涤上层脂肪酸直至其中无硫酸，将脂肪酸层收集到一个小烧杯中，置于蒸气浴上加热，直至水层分离，脂肪酸层变得澄清。趁热将脂肪酸层转至一个干燥的烧杯中，在105℃干燥20分钟。将此温热的脂肪酸放置到一个合适的容器中，在冰浴中冷却至凝固。

完全造化检测：取3ml干燥的以上脂肪酸于试管中，加入15ml乙醇。加热混合溶液至沸腾，加入等体积的6N浓度的氨水，溶液应变的澄清。

装置：

file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.jpg

如上图所示。装油样品的为25×100mm的试管，安装有短程温度计，悬置于试管中；30cm长的，底端弯成围绕温度计的平面圆环作为搅拌器。短程温度计的量程应不超过30°，具0.1°的刻度。样品试管应配有橡胶塞，并置于密闭防水的直径50mm，长11cm的圆柱体容器中，而这个圆柱体容器则被置于一个浴锅中，该浴锅能够使圆柱体容器底部和侧面都被37mm厚的溶液包围。浴锅应配有温度计。

方法：如果样品是固体，则先在不超过预估凝固点20℃的温度下加热融化，将液体样品倒入试管中，使其高度为50-57mm左右，将试管中温度计的感温包整个置于样品液体中，但不触及管底。将浴锅用比样品预估凝固点低4-5℃的液体注满至离试管顶部12mm的高度。如果样品在室温下就是液体，则用比样品预估凝固点低15℃的液体冲注浴锅。当样品被冷却至其凝固点之上5℃时，调整浴锅中液体温度至比样品预估凝固点低7-8℃。在接下来的冷却过程中，持续地将平面环形搅拌器提起放下，以此来搅拌样品，搅拌频率应一分钟上下来回20次。

（也许可以通过用温度计刮擦试管壁来引导样品凝固）冷却液温度不能超过规定温度，否则试样应重做。

每隔 3 0秒观察温度计读数1 次。在温度缓缓下降的过程中，不断搅拌供试品，直至温度恒定或开始上升，停止搅拌。每隔30秒记录试管内温度一次，持续至少3分钟直至温度重新开始下降。

不低于4次的读数的变化在0.2°之内的温度构成样品凝固温度，取其平均值为凝固温度。

脂肪酸组分

标准溶液：Nu-Chek17A或者 Nu-Chek 19A。

0.5N氢氧化钠甲醇溶液：将2克氢氧化钠溶于100ml甲醇即得。

试液：如果油样品中含有双键数多于两个的脂肪酸，则先往烧瓶里面充氮气几分钟，将其中的空气置换完全。称取约100mg样品于一个50ml的，安装有合适的循环水冷凝器，配有电磁搅拌棒的锥形瓶（已氮气置换），加入4ml 0.5N氢氧化钠甲醇溶液，加热回流至脂肪油滴消失，通常在5-10分钟的时间。取5ml用14g三氟化硼溶于甲醇制得的100ml溶液，加入烧瓶中，旋摇烧瓶使混合，加热回流2分钟。通过冷凝器往烧瓶中加入4ml色谱纯的庚烷，继续回流1分钟。冷却烧瓶，移去冷凝器，加入约15ml饱和氯化钠溶液，振摇，然后静置使分层。将庚烷层溶液通过0.1g已事先用色谱纯庚烷洗涤过的无水硫酸钠，收集滤液到合适的烧杯中。取1.0ml此溶液至一个10ml的容量瓶，用色谱纯庚烷稀释至刻度，混合均匀。

系统适用性溶液：量取硬脂酸、棕榈酸、油酸各20mg至一个25ml的，安装有合适的循环水冷凝器，配有电磁搅拌棒的锥形瓶，取5ml用14g三氟化硼溶于甲醇制得的100ml溶液，加入烧瓶中，旋摇烧瓶使混合，加热回流2分钟。通过冷凝器往烧瓶中加入4ml色谱纯的庚烷，继续回流1分钟。冷却烧瓶，移去冷凝器，加入约15ml饱和氯化钠溶液，振摇，然后静置使分层。将庚烷层溶液通过0.1g已事先用色谱纯庚烷洗涤过的无水硫酸钠，收集滤液到合适的烧杯中。取1.0ml此溶液至一个10ml的容量瓶，用色谱纯庚烷稀释至刻度，混合均匀。

色谱系统：气相色谱应配备火焰离子检测器，检测器温度维持在260℃；不分流进样系统；0.53mm×30m，USP固定相 phase G16键合的石英毛细管。进样后保持色谱柱温70℃2分钟，然后以5°每分钟的速度升温至240℃，然后维持该温度5分钟。进样口温度维持在约220℃。载气为氦气，线速度为50cm/s。

将系统适用性溶液作色谱分析，记录色谱图。棕榈酸甲酯相对保留时间为0.87，硬脂酸甲酯相对保留时间为0.99，油酸甲酯相对保留时间为1.0。硬脂酸甲酯和油酸甲酯峰的分离度大于1.5，棕榈酸和硬脂酸各自重复进样几次所得峰面积的相对标准偏差均不大于6.0%，并且这几次重复进样所得的棕榈酸峰面积与硬脂酸峰面积的比例的相对标准偏差不大于1.0%。

方法：分别注入等量的标准溶液和试液各1μL，记录色谱图，根据标准溶液中各峰保留时间确定试液中各脂肪酸酯的峰，并测量试液中各脂肪酸酯的峰面积。通过以下公式计算每个脂肪酸的比例：

100（A/B）

其中，A是各脂肪酸酯单独的峰面积，B是试液中除了溶剂峰的所有峰面积的总和。

Omega-3脂肪酸测定和简况

以下方法用于测定EPA, DHA等，保护溶液不受光化光、氧化剂、氧化催化剂、空气的影响。

EPA和DHA的含量

USP标准品：USP二十二碳六烯酸乙酯标准品，USP二十碳五烯酸乙酯标准品，USP二十三酸甲酯标准品。

抗氧化溶液：精确称一定量的丁羟甲苯，溶于一定体积的2,2,4-三甲基戊烷配制成0.05mg/ml的溶液。

内标溶液：精确称一定量的USP二十三酸甲酯于一个容量瓶中，用抗氧化溶液溶解并稀释得到7.0mg/ml的溶液。（使用时应防蒸发）

Approximate sum of EPA+DHA	Amount of sample to be weighed
30%-50%	0.4-0.5
50%-70%	0.3
70%-80%	0.25

试液1（对甘油酯）：参考上表，往10ml的容量瓶中用抗氧化溶液溶解一定量的样品，并用该溶液稀释至刻度。取2ml配制好的溶液于一个玻璃试管中，往试管中吹氮气使溶剂蒸发。往试管中加入1.5ml，2%（w/v）的氢氧化钠甲醇溶液，用含有聚四氟乙烯內垫的盖子盖紧，旋摇溶液使混合，然后放置到沸水浴中加热7分钟。冷却，加入2ml的三氯化硼甲醇溶液（120g三氯化硼溶于1000ml甲醇而得），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，在沸水浴中加热30分钟。冷却至40-50℃，加入1ml 2,2,4-三甲基戊烷，盖紧盖子，猛烈振摇30秒或在旋涡混合器中混合30秒，然后立即加入5ml饱和氯化钠溶液（氯化钠和水按体积比1:2配制而成，配制好后应经常振摇，使固体溶解完全，若有不容物，则应过滤除去），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，猛烈振摇15秒或在旋涡混合器中混合15秒。静置使分层，待上层溶液澄清后将其转移至另一个试管中。再用1ml 2,2,4-三甲基戊烷萃取甲醇层，并将此萃取液与之前的合并。用水洗涤合并后的萃取液两次，每次用水1ml，之后用无水硫酸钠干燥有几层。

试液2（对甘油酯）：取与配制试液1相同量的样品于容量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度。如果溶液不澄清，则缓缓加热至60℃使澄清。取2ml配制好的溶液于一个玻璃试管中，往试管中吹氮气使溶剂蒸发。往试管中加入1.5ml，2%（w/v）的氢氧化钠甲醇溶液，用含有聚四氟乙烯內垫的盖子盖紧，旋摇溶液使混合，然后放置到沸水浴中加热7分钟。冷却，加入2ml的三氯化硼甲醇溶液（120g三氯化硼溶于1000ml甲醇而得），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，在沸水浴中加热30分钟。冷却至40-50℃，加入1ml 2,2,4-三甲基戊烷，盖紧盖子，猛烈振摇30秒或在旋涡混合器中混合30秒，然后立即加入5ml饱和氯化钠溶液（氯化钠和水按体积比1:2配制而成，配置好后应经常振摇，是固体溶解完全，若有不容物，则应过滤除去），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，猛烈振摇15秒或在旋涡混合器中混合15秒。静置使分层，待上层溶液澄清后将其转移至另一个试管中。再用1ml 2,2,4-三甲基戊烷萃取甲醇层，并将此萃取液与之前的合并。用水洗涤合并后的萃取液两次，每次用水1ml，之后用无水硫酸钠干燥有几层。

试液3（对乙酯）：根据上表，称取一定量的样品于10ml的容量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，如果溶液不澄清则缓缓加热至60℃使澄清。

试液4（对乙酯）：取同试液3等量的样品于10ml的容量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，如果溶液不澄清则缓缓加热至60℃使澄清。

标准溶液1：精确称量USP二十二碳六烯酸乙酯标准品和USP二十碳五烯酸乙酯标准品各0.10g于一个10ml的容量瓶中，用内标溶液溶解并稀释刻度。如果溶液不澄清则缓缓加热至60℃使澄清。

标准溶液2：取标准溶液1 2.0ml于一支玻璃试管中，缓缓通入氮气流使溶剂蒸发，往试管中加入1.5ml，2%（w/v）的氢氧化钠甲醇溶液，用含有聚四氟乙烯內垫的盖子盖紧，旋摇溶液使混合，然后放置到沸水浴中加热7分钟。冷却，加入2ml的三氯化硼甲醇溶液（120g三氯化硼溶于1000ml甲醇而得），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，在沸水浴中加热30分钟。冷却至40-50℃，加入1ml 2,2,4-三甲基戊烷，盖紧盖子，猛烈振摇30秒或在旋涡混合器中混合30秒，然后立即加入5ml饱和氯化钠溶液（氯化钠和水按体积比1:2配制而成，配制好后应经常振摇，使固体溶解完全，若有不容物，则应过滤除去），用氮气置换管中空气，盖紧盖子，猛烈振摇15秒或在旋涡混合器中混合15秒。静置使分层，待上层溶液澄清后将其转移至另一个试管中。再用1ml 2,2,4-三甲基戊烷萃取甲醇层，并将此萃取液与之前的合并。用水洗涤合并后的萃取液两次，每次用水1ml，之后用无水硫酸钠干燥有几层。

系统适用性溶液1：精确称量棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、花生酸甲酯、山萮酸甲酯各0.30g于一个10ml的容量瓶中，用抗氧化溶液溶解并稀释至刻度。

系统适用性溶液2：精确称取55.0mg二十二碳六烯酸甲酯，5.0mg神经酸甲酯于一个10ml的容量瓶中，用抗氧化溶液溶解并稀释至刻度。

色谱条件：气相色谱配备火焰离子检测器；0.25mm×250m，USP固定相G16 厚0.2μm的涂层石英毛细管；检测器温度维持在270℃，进样口温度维持在250℃；柱温初始在170℃维持2分钟，然后以3℃每分钟的速度升至240℃并在该温度维持2.5分钟。以氦气作为载气，分流比为1:200，流速为1ml/min。对系统适用性溶液1和系统适用性溶液 2做色谱分析；对于系统适用性溶液1各峰面积百分比按如下次序递增，棕榈酸甲酯-硬脂酸甲酯-花生酸甲酯—山嵛酸甲酯，并且棕榈酸甲酯和山嵛酸甲酯的百分比面积之差不大于2个面积百分比单位；对于系统适用性溶液2，二十二碳六烯酸甲酯峰和神经酸甲酯峰之间的分离度大于1.2。对甘油酯，对标准溶液1和标准溶液2做色谱分析，对于DHA和EPA，各自的脂肪酸乙酯衍生为脂肪酸甲酯的比率不高于90%。

方法：标准溶液1，标准溶液2，试液1，试液2，试液3，试液4分别进样2次相等体积，约1微升，记录各自的色谱图，通过比对试液1和试液2的图谱确定内标峰的保留时间，另外通过比对试液3和试液4的图谱确定内标峰的保留时间。

按如下公式计算甘油酯中EPA或者DHA的百分比：

100F(C/W)(RU/RS)

其中，F是用游离脂肪酸表示DHA或EPA含量的因子，DHA的F为0.921，EPA的F为0.915；C是标准溶液2中EPA或DHA的浓度，mg/ml；W是配制试液1的样品量，mg；RS是标准溶液2图谱中EPA或DHA峰响应与内标物峰响应的比值；RU是校正后的试液1图谱中EPA或DHA峰响应与内标物峰响应的比值，按下式计算而得：

1/(ru2/rT2-ru1/rT1)

其中，ru2是试液2所得色谱图中内标物位置峰的峰响应；ru1是试液1所得色谱图中内标物位置峰的峰响应；rT1是试液1所得图谱中EPA或DHA的峰响应；rT2是试液2所得图谱中EPA或DHA的峰响应。

按如下公式计算乙酯中EPA或者DHA的百分比：

100F(C/W)(RU/RS)

其中，F是用游离脂肪酸表示DHA或EPA含量的因子，DHA的F为0.921，EPA的F为0.915；C是标准溶液1中EPA或DHA的浓度，mg/ml；W是配制试液3的样品量，mg；RS是标准溶液1图谱中EPA或DHA峰响应与内标物峰响应的比值；RU是校正后的试液3图谱中EPA或DHA峰响应与内标物峰响应的比值，按下式计算而得：

1/(ru2/rT2-ru1/rT1)

其中，ru2是试液3所得色谱图中内标物位置峰的峰响应；ru1是试液4所得色谱图中内标物位置峰的峰响应；rT1是试液4所得图谱中EPA或DHA的峰响应；rT2是试液3所得图谱中EPA或DHA的峰响应。

0mega-3酸总含量

按如下公式计算Omega-3酸总含量：

EPA+DHA+((An-3×(EPA+DHA))/(AEPA+ ADHA) )

其中，EPA和DHA分别表示EPA和DHA的含量试验中得到的EPA和DHA的含量，mg/g；An-3是试液1得到的图谱中C18:3n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3, C22:5 n-3甲酯的峰面积总和或者试液4得到的图谱中对应的乙酯峰的峰面积总和；AEPA是试液1得到的图谱中EPA甲酯的峰面积或者试液4中得到的EPA乙酯的峰面积；ADHA是试液1得到的图谱中DHA甲酯的峰面积或者试液4中得到的DHA乙酯的峰面积。

不挥发油中的水和沉积物

装置：所用离心机直径最好为38-43cm，转速为1500rpm，如果所用离心机直径不同，则按下式换算以得到所需的转速：

rpm=1500根号40.6/d

离心管需用梨形的并能封口，每支容积大约125ml，刻度清晰清楚，并且由下往上的读数与下表由上往下的读数相符合：

Volume (ml)	Scale Division (ml)
0-3	0.1
3-5	0.5
5-10	1.0
10-25	5.0
25-50	25.0
50-100	50.0

方法：往两支离心管中各加入50.0ml苯，再各加入50.0ml油样品，如果样品中有离析的硬脂酸甘油应先加热使其融化，并在25℃混合彻底。将离心管塞上塞子，猛烈振摇使溶液混合均匀，然后将试管放入50℃的水浴中加热10分钟。离心10分钟。对试管底部的水和沉积物读数。间断地离心几次，每次10分钟，直至水和沉积物体积连续三次读数恒定为止。两支试管水和沉积物体积的总和表示油样品中水和沉积物的体积比例。

微量金属

装置：通常包括以下仪器：

消化瓶：120ml的聚四氟乙烯瓶，具气密性的封口，调整瓶内气压的阀，有释放气体的聚四氟乙烯材质的管。

系统：保证烧瓶具有气密性，对每个烧瓶使用同样的扭力。

微波炉：2450MHz，输出功率可以从0按1%的比率升到630±70W，可编程数字计算机，聚四氟乙烯材质的微波炉内腔，可调速排风扇，可旋转转盘，排烟管道。

原子吸收光谱仪：空心阴极灯作为放射源，氘灯做背景校正器，还应配备以下附件：

1.石墨炉作为镉、铜、铁、铅、镍、锌的原子化装置

2.用于汞和砷的自动化的氰化物蒸汽持续气流生成系统

一般程序

注意操作安全。

清洁：所有玻璃仪器和实验设备在使用前都需经10mg/ml的硝酸清洗。

无微量金属硝酸：硝酸所含As, Cd,Cu, Fe, Hg, Pb, Ni, Zn的最大量分别不大于0.005, 0.005, 0.001, 0.02, 0.002, 0.001, 0.005, 0.01 ppm。

无微量金属盐酸：盐酸所含As, Cd,Cu, Fe, Hg, Pb, Ni, Zn的最大量分别不大于0.005, 0.003, 0.003, 0.05, 0.005, 0.001, 0.004, 0.005 ppm。

无微量金属硫酸：硫酸所含As, Cd,Cu, Fe, Hg, Pb, Ni, Zn的最大量分别不大于0.005, 0.002, 0.001, 0.05, 0.005, 0.001, 0.002, 0.005ppm。

检测贮备液：往消化瓶中加入精确称量的约0.5g脂肪酸，加入6ml无微量金属硝酸，4ml无微量金属盐酸。密封烧瓶。

空白贮备液：将6ml无微量金属硝酸和4ml无微量金属盐酸加入一个消化瓶中。

试液1：将含有检测贮备液的消化瓶置于微波炉中，按下列步骤进行消化：80%功率消化15分钟，100%功率消化5分钟，80%功率消化20分钟。

消化完毕后让消化瓶冷却。加入4ml无微量金属硫酸，重复以上消化步骤，待消化完毕，将消化瓶冷却至室温。打开生成的消化瓶，将澄清无色的溶液转移至一个50ml的容量瓶中，用水冲洗消化瓶2次，每次用水15ml，将洗液收集至同一容量瓶中。往该容量瓶中加入1.0ml，10mg/ml的硝酸镁溶液和1.0ml，100mg/ml的磷酸二氢铵溶液，用水稀释至刻度，混合均匀，作为试液1。

空白液1：将含有空白贮备液的消化瓶置于微波炉中，按下列步骤进行消化：80%功率消化15分钟，100%功率消化5分钟，80%功率消化20分钟。

消化完毕后让消化瓶冷却。加入4ml无微量金属硫酸，重复以上消化步骤，待消化完毕，将消化瓶冷却至室温。打开生成的消化瓶，将澄清无色的溶液转移至一个50ml的容量瓶中，用水冲洗消化瓶2次，每次用水15ml，将洗液收集至同一容量瓶中。往该容量瓶中加入1.0ml，10mg/ml的硝酸镁溶液和1.0ml，100mg/ml的磷酸二氢铵溶液，用水稀释至刻度，混合均匀，作为试液1。

直接校正：常规测量需要3份标准溶液，一份空白液1，一份试液1。

按照上文配制或使用上文所说的试液1和空白液1。配制不少于3份的含所有待测金属元素的标准溶液，试液1中各金属元素的吸收值应在校正后的吸收范围内，最好处于吸收范围中间。用于配制试液1的各金属元素添加到标准溶液中的浓度应相同。

将以上各溶液取相同的份数做检测，以此来获得连续的读数。

以标准溶液读数的平均值作为浓度来做校正曲线，根据校正曲线来测定试液1中各金属元素的浓度。

标准添加：往4个相同容积的容量瓶中添加等量的试液1，按等量递增的方式往瓶中添加标准溶液，以此来获得在校正曲线范围内的读数。用各论里规定的溶剂稀释容量瓶中的溶液并混匀。没有添加比偶准溶液的试液瓶标为试液。

将以上各溶液取相同的份数做检测，以此来获得连续的读数。

根据添加的标准液的浓度，标出标准溶液和试液的吸收值的点（试液的标准液添加量应视为零）。连接各点做曲线直至与浓度坐标线相交。与浓度坐标线相交和各点在浓度坐标线上之间的距离即表示试液中各元素的浓度。

特殊测试

Cd,Cu, Fe, Pb, Ni, Zn

标准贮备液：配制含各金属元素浓度为5微克每毫升的溶液。

标准溶液：分别取10微升，20微升，40微升标准贮备液于3个相同的容量瓶中，再往每个容量瓶中添加5.0nl试液1，用水稀释至刻度，混匀待用。

试液2：往一个10ml的容量瓶中添加5.0ml的试液1，用水稀释至刻度，混匀待用。

空白液2：往一个10ml的容量瓶中添加5.0ml的空白液1，用水稀释至刻度，混匀待用。

方法：用合适的石墨炉原子吸收分光光度计检测各金属元素的含量。同时测定空白液2，标准溶液和试液2的吸收值至少各3次。将保准溶液和试液2测得的吸收值减去空白液2测得的吸收值。参照标准添加中的方法进行操作。

As,Hg

用自动化的氢化物连续气流生成系统，按照直接校正的方法，测量标准溶液中As和Hg的浓度。

如果As和Hg的规格限度是1ppm，则配制3份两个元素浓度皆分别为5ng/ml, 10ng/ml, 20ng/ml的工作校准液。

试液的吸收值都应减去空白液的吸收值。

As

空白液3：取1.0ml，200mg/ml的碘化钾溶液与19.0ml的空白液1混合。在室温静置50分钟，或70℃加热4分钟。

试液3：取1.0ml，200mg/ml的碘化钾溶液与19.0ml的试液1混合。在室温静置50分钟，或70℃加热4分钟。

酸试剂1：无微量金属盐酸

还原剂：含硼氢化钠6mg/ml，氢氧化钠5mg/ml的溶液。

Hg

空白液4：按空白液3步骤操作。

试液4：按试液3步骤操作。

酸试剂2：515mg/ml的无微量金属盐酸。

还原剂2：含氯化亚锡10mg/ml，无微量金属盐酸200mg的溶液。

甾醇组分

分离甾醇馏分

对照溶液A：配制浓度为5%（w/v）的胆固醇氯仿溶液。

展开剂：甲苯：丙酮（95:5）或者己烷：乙醚（65:35）

试液A: 精确称取5g试样至250ml的烧瓶中，加入50ml，2N浓度的氢氧化钾乙醇溶液，加热至微沸并不断搅拌直至皂化（溶液变透明）。继续加热20分钟，从冷凝管顶端加入50ml水。将烧瓶冷却至30℃。将瓶中溶液转移至一个500ml的分液漏斗中，并用50ml水分几次冲洗烧瓶，合并洗液。加入80ml乙醚，猛烈振摇约30秒，静置分层。如果产生乳化层，则加以喷雾的方式加入少量乙醇或甲醇。分离收集下层液体至另一个分液漏斗中，重复萃取过程2次，每次用乙醚60-70ml。将萃取液转移至另一个分液漏斗中。用水洗涤收集的乙醚层，直至洗液不再对酚酞显碱性。用无水硫酸钠干燥乙醚层，并通过无水硫酸钠层过滤至一个已称量的250ml烧瓶中。将乙醚蒸馏至只剩几毫升的体积，并用真空或氮气流干燥，并在100℃干燥15分钟，在干燥器中冷去后称量。将不皂化物溶于氯仿生成约5%浓度的溶液。

试液B：精确称取5g菜籽油至250ml的烧瓶中，加入50ml，2N浓度的氢氧化钾乙醇溶液，加热至微沸并不断搅拌直至皂化（溶液变透明）。继续加热20分钟，从冷凝管顶端加入50ml水。将烧瓶冷却至30℃。将瓶中溶液转移至一个500ml的分液漏斗中，并用50ml水分几次冲洗烧瓶，合并洗液。加入80ml乙醚，猛烈振摇约30秒，静置分层。如果产生乳化层，则加以喷雾的方式加入少量乙醇或甲醇。分离收集下层液体至另一个分液漏斗中，重复萃取过程2次，每次用乙醚60-70ml。将萃取液转移至另一个分液漏斗中。用水洗涤收集的乙醚层，直至洗液不再对酚酞显碱性。用无水硫酸钠干燥乙醚层，并通过无水硫酸钠层过滤至一个已称量的250ml烧瓶中。将乙醚蒸馏至只剩几毫升的体积，并用真空或氮气流干燥，并在100℃干燥15分钟，在干燥器中冷去后称量。将不皂化物溶于氯仿生成约5%浓度的溶液。

试液C：精确称取5g向日葵油至250ml的烧瓶中，加入50ml，2N浓度的氢氧化钾乙醇溶液，加热至微沸并不断搅拌直至皂化（溶液变透明）。继续加热20分钟，从冷凝管顶端加入50ml水。将烧瓶冷却至30℃。将瓶中溶液转移至一个500ml的分液漏斗中，并用50ml水分几次冲洗烧瓶，合并洗液。加入80ml乙醚，猛烈振摇约30秒，静置分层。如果产生乳化层，则加以喷雾的方式加入少量乙醇或甲醇。分离收集下层液体至另一个分液漏斗中，重复萃取过程2次，每次用乙醚60-70ml。将萃取液转移至另一个分液漏斗中。用水洗涤收集的乙醚层，直至洗液不再对酚酞显碱性。用无水硫酸钠干燥乙醚层，并通过无水硫酸钠层过滤至一个已称量的250ml烧瓶中。将乙醚蒸馏至只剩几毫升的体积，并用真空或氮气流干燥，并在100℃干燥15分钟，在干燥器中冷去后称量。将不皂化物溶于氯仿生成约5%浓度的溶液。

方法：将TLC板（20cm×20cm，200微米厚的聚酯硅胶层，粒径5-17微米）在0.2N的氢氧化钾乙醇溶液中完全浸泡10秒钟，在通风橱中干燥2小时，再在100℃干燥1小时。在使用之前应将处理过的硅胶板保存在干燥器中，并在15天内使用。

将甲苯：丙酮（95:5）或者己烷：乙醚（65:35）倒入展开缸中形成约1cm的液体层。盖上缸盖，静置至少30分钟。用0.3ml的试液A在距TCL板底端2cm处尽可能薄和均匀地划线。在划线的一段用对照溶液A2-3微升画点。将TCL板置于展开缸中跑板，直至溶剂前沿跑至距板顶端1cm处。将TLC板取出，用热气流干燥，避免温度过高。往板上喷雾0.2%浓度的2,7-二氯荧光素醇溶液，在254nm的紫外灯下观察。根据对照液A点跑的距离确定每张板上试液中甾醇带的位置，将其划出，并将其上下各2-3mm的可见区域划入。将划定的硅胶转移至装有G3多孔隔膜的过滤漏斗中，加入10ml热的氯仿，用小铁铲小心搅拌，真空抽滤，将滤液收集至与分液漏斗配套的锥形瓶中。用乙醚冲洗分液漏斗3次，每次10ml，将洗液收集至同一锥形瓶中。将滤液蒸发至只剩4-5毫升，将残留溶液转移至一个已事先称重的10ml,底端尖形，有封口塞子的试管中，用温和的热氮气流将残留溶液蒸发干。将残留溶解于几滴丙酮中，再次蒸干。在105℃加热10分钟，然后放入干燥器中冷却，冷却后称量。

对试液B和试液C做相同处理。

甾醇的测定

试液D：往含有样品所得甾醇馏分的试管中加入无水吡啶、六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷按9:3:1的比例配制的混合物，加入量为50微升对应1mg甾醇，应避免水分的摄入。盖上试管塞，小心振摇试管直至甾醇完全溶解。在环境温度下放置至少15分钟，如有必要，离心几分钟，收集上层澄清液。

注意：如果有微微的乳白光生成，是正常的；但是，如果有白色絮状物或者粉红色出现，则说明溶液中有水分，或者试剂分解了，这是应重新配制试液。

对照溶液E：取9份薄层色谱分离菜籽油得到的甾醇，往其中加入1份胆固醇，加入无水吡啶、六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷按9:3:1的比例配制的混合物，加入量为50微升对应1mg甾醇，应避免水分的摄入。盖上试管塞，小心振摇试管直至甾醇完全溶解。在环境温度下放置至少15分钟，如有必要，离心几分钟，收集上层澄清液。

对照溶液F: 取薄层色谱分离太阳花油得到的甾醇，往其中加入无水吡啶、六甲基二硅氮烷、三甲基氯硅烷按9:3:1的比例配制的混合物，加入量为50微升对应1mg甾醇，应避免水分的摄入。盖上试管塞，小心振摇试管直至甾醇完全溶解。在环境温度下放置至少15分钟，如有必要，离心几分钟，收集上层澄清液。

色谱系统：火焰离子检测器，玻璃或熔融硅胶毛细管柱，长20-30m，内径0.25-0.32mm,完全覆盖0.10-0.30微米厚的G27或 G36固定相涂层。进样口温度280℃，检测器温度290℃，柱温维持在260±5°。载气为氦气，流速20-35cm每秒，或氢气，流速30-50cm每秒。分流比为1:50-1:100。对对照溶液E和对照溶液F做色谱分析，记录色谱峰。β-谷甾醇的保留时间应为20±5分钟，并且所有的甾醇都应开明显分离开。对照溶液E所得色谱图显示4个主峰，分别为胆固醇、菜籽甾醇、菜油甾醇以及β-谷甾醇；对照溶液F所得图谱显示4个主峰，分别为菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇以及7-豆甾醇。各甾醇相对β-谷甾醇的保留时间参见表格3.

甾醇	G36柱	G27柱
胆固醇	0.67	0.63
菜籽甾醇	0.73	0.71
24-亚甲基-胆固醇	0.82	0.80
菜油甾醇	0.83	0.81
campestanol	0.85	0.82
谷甾醇	0.88	0.87
7-菜油甾醇	0.93	0.92
5,23-豆甾二烯醇	0.95	0.95
赤桐甾醇	0.96	0.96
β-谷甾醇	1.00	1.00
二氢谷甾醇	1.02	1.02
5- avenasterol	1.03	1.03
5,24-豆甾二烯醇	1.08	1.08
7-豆甾烯醇	1.12	1.12
7- avenasterol	1.16	1.16

方法：分别进样试液D，对照溶液E，对照溶液F各1微升，记录色谱图，测量甾醇的峰面积，按下面公式计算馏分中每个甾醇的百分比：

100(A/S)

其中，A是待测定的甾醇的峰面积，S是其它的在表3中标有的其它峰的总和。

mageejun

辛苦了，不好意思的收下！

一沙一叶

太赞了。

钱江缘梦

谢谢楼主的分享，辛苦了

liruixin8326

学习一下。   

彤枫飘零

辛苦，谢谢分享，学习

宝丽金

彤枫飘零 发表于 2015-12-4 12:49
辛苦，谢谢分享，学习

怎么发现的呢？

sunyang4989

谢谢楼主，辛苦啦！

kevin1196

感谢分享

后生小辈

楼主神人也。。。