药物单次给药毒性指导原则（征求意见稿）

法规君

药物单次给药毒性试验技术指导原则

（第二稿）

一、概述

急性毒性（Acutetoxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应[1、2]。狭义的单次给药毒性试验（Singledose toxicity study）是指为获得药物单次给予后的急性毒性反应的试验[2]。本指导原则所指单次给药毒性试验是广义的单次给药毒性试验，通常，可采用单次或24小时内多次给药的方式获得药物急性毒性信息。

拟用于人体的药物通常需要进行单次给药毒性试验[注1]。单次给药毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。单次给药毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量急性中毒相关的信息[1]。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的单次给药毒性试验研究。

二、基本原则

（一）试验管理

药物的单次给药毒性试验属于安全性评价研究，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析

单次给药毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。

对于化学药，应根据受试物的结构特点、理化性质、同类化合物情况、适应症和用药人群特点、试验目的等选择合适的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其它药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。

对于中药和天然药物，还应考虑到其与化学药的不同特点，选择合适的试验方法。由于中药、天然药物情况复杂，试验时应根据各自不同的情况进行针对性设计。

（三）随机、对照、重复

单次给药毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复。

三、基本内容（一）受试物

中药、天然药物：受试物应能充分代表临床试验样品或上市药品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、规格及生产单位。

化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。试验中所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产单位，并符合试验要求。

在药品研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。

化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。

（二）实验动物[1、3、4]

1、 种属：不同种属的动物各有其特点，对同一药物的反应会有所不同。啮齿类动物和非啮齿类动物的单次给药毒性可能在质还是量上会存在差别。从充分暴露受试物毒性的角度考虑，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获得较为充分的安全性信息。因此，对于化学药，单次给药毒性试验应采用至少两种哺乳动物进行试验，一般应选用一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。若未采用非啮齿类动物进行试验，应阐明其合理性。对于中药、天然药物，根据具体情况，可选择啮齿类和/或非啮齿类动物进行试验（参见附录二）。

动物应符合国家有关规定的等级要求，并具有实验动物质量合格证。

2、 性别：通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。若采用单性别动物进行试验，应阐明其合理性。

3、 年龄：通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童或可能用于儿童，必要时应采用幼年动物进行试验。

4、 动物数：应根据动物种属和研究目的来确定所需的动物数。动物数应符合试验方法及结果分析评价的需要。

5、 体重：动物初始给药时体重不应超过或低于平均体重的20%。

（三）给药途径

给药途径不同，受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同。通常，给药途径应至少包括临床拟用途径。如不采用临床拟用途径，必须充分说明理由。

胃内容物会影响受试物的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响到药物代谢酶活性和受试物肠道内吸收，从而影响毒性的暴露。因此，经口给药前动物一般应进行一段时间的禁食，不禁水。

（四）试验方法和给药剂量[1 、3、4]

单次给药毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。单次给药毒性试验的试验方法较多，常用的试验方法有近似致死量法、最大给药量法、最大耐受量法、固定剂量法、上下法（序贯法）、累积剂量法（金字塔法）、半数致死量法等。

研究者应根据受试物的特点，选择合适的方法进行急性毒性研究，根据不同的试验方法选择合适的剂量水平[注2]。

总体上，给药剂量应包括从未见毒性剂量到出现严重毒性 (危及生命的) 的剂量。

必要时应设空白和/或溶媒（辅料）对照组。

不同动物和给药途径下的最大给药容量可参考相关文献及根据实际情况来确定。

（五）观察时间及指标[1、3、4、5]

给药后，一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应的出现时间及恢复时间、动物死亡时间等。如果毒性反应出现较慢或恢复较慢，应适当延长观察时间。

观察指标包括临床症状（如动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前、试验结束处死前各称重一次，观察期间可多次称重，动物死亡时应称重）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状的起始时间、严重程度、持续时间等。

所有的试验动物应进行大体解剖，试验过程中因濒死而处死的动物、死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后处死并进行大体解剖。当组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，应进行组织病理学检查。

在一些情况下，为获得更为全面的急性毒性信息，可设计多个剂量组，观察更多的指标，如血液学指标、血液生化学指标、组织病理学检查等，通过这些设计，更好地确定毒性靶器官或剂量反应关系[2、5]。

四、数据分析及评价

1、 根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量－反应及时间－反应关系。

2、判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统（参考附录一）等。

3、根据大体解剖中肉眼可见的病变和组织病理学检查的结果，初步判断可能的毒性靶器官。组织病理学检查报告应经病理学检查负责人签名和病理学检查单位盖章，检查报告应详细描述，尤其是有异常变化的组织。对于有异常变化者，应附有相应的组织病理学照片。

4、说明所使用的计算方法和统计学方法，必要时提供所选用方法合理性的依据。

5、根据各种反应在不同剂量下出现的时间、发生率、剂量-反应关系、不同种属动物及实验室的历史背景数据、病理学检查结果以及同类药物的特点，判断所出现的反应与药物的相关性。判断受试物引起的毒性反应性质、严重程度、可恢复性以及安全范围；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查的结果，初步判断毒性靶器官。

单次给药毒性试验的结果可作为后续毒理试验剂量选择的参考，也可提示一些后续毒性试验需要重点观察的指标。

五、名词解释

最大给药量（Maximal Feasible dose，MFD）：指动物单次或24小时内多次（2~3次）给药所采用的最大给药剂量。

最大耐受量（Maximal tolerance dose，MTD）：是指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。

半数致死量（Medianlethal dose，LD50）：预期引起50%动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。

六、注释

注1：急性毒性的充分信息也可从其他来源获得，如可从实施适当的剂量递增试验或短期的剂量范围试验中所获得。 [2、6]。

注2：试验方法不同，所采用的给药剂量不同。试验者可参考相关的文献进行试验设计，但应注意，由于中药、天然药物的预期临床用药剂量通常较大，因此单次给药毒性试验方法中所规定的剂量限度（如上下法中的2000mg/kg或5000mg/kg的剂量限度）仅适用于化学药，中药、天然药物的剂量设计应综合考虑多方面因素进行确定。

七、参考文献

1、CDER,FDA. Guidance for industry: single dose acute toxicity testing forpharmaceuticals (Final).1996

2、CHMP，EMA. Questions and answers on the withdrawal of the 'Note for guidanceon single dose toxicity.2010

3、CordierA. Single dose toxicity: Industry perspectives. In: P.F. D’Arcy and D.W.G.Harron edited, Proceedings of the First International Conference onHarmonization. Brussels: 1991, 189-191

4、Outcome -Single dose toxicity. In: P.F. D’Arcy and D.W.G. Harron edited, Proceedings ofthe First International Conference on Harmonization. Brussels: 1991, 184

5、ICH M3(R2) .Nonclinical Safety Studies forthe Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization forPharmaceuticals.2009

6、Blazka M E,Hayes A W. Acute toxicity and eye irritancy. In: Hayes A W edited, Principlesand methods of toxicology. Fifth edition, 2007:1132-1150

八、附录

（一）急性毒性试验的一般观察和指征[7]

以下列出了一些常见的观察指征及其可能涉及的组织、器官和系统。该表格仅作为结果分析评价的参考，其他科学、合理的分析均是可以接受的；急性毒性试验中，可能需要对该表格中列出的全部或部分指征进行观察。

        

观察

      

   

指     征

   

可能涉及的组织、器官或系统

  
   

I. 鼻孔呼吸阻塞，呼吸频率和深度改变，体表颜色改变。

  

A.

  

呼吸困难：呼吸困难或费力，喘息，通常呼吸频率减慢

  

   

1.  腹式呼吸：膈膜呼吸，吸气时腹部明显塌陷

  

CNS呼吸中枢，肋间肌麻痹，胆碱能神经麻痹

   

2.喘息：吸气很困难，伴随有喘息声

  

CNS呼吸中枢，肺水肿，呼吸道分泌物蓄积，胆碱能功能增强

   

B.

  

呼吸暂停：用力呼吸后出现短暂的呼吸停止

  

CNS呼吸中枢，肺心功能不全

   

C.

  

紫绀：尾部、口和足垫呈现蓝紫色

  

肺心功能不全，肺水肿

   

D.

  

呼吸急促：呼吸快而浅

  

呼吸中枢刺激，肺心功能不全

   

E.

  

鼻分泌物：红色或无色

  

肺水肿，出血

   

II. 运动功能：运动频率和特点的改变。

  

A.

  

自发活动、探究、梳理、运动增加或减少

  

躯体运动，CNS

   

B.

  

嗜睡：动物嗜睡，但可被刺激唤醒而恢复正常活动

  

CNS睡眠中枢

   

C.

  

正常反射消失：当以背部放置时保持正常姿势的翻正反射消失

  

CNS，感觉，神经肌肉

   

D.

  

麻痹：正常反射和疼痛反应消失

  

CNS，感觉

   

E.

  

僵住：保持原姿势不变

  

CNS，感觉，神经肌肉，自主神经  

   

F.

  

共济失调：动物行走时无法控制和协调运动，但无痉挛、局部麻痹、轻瘫或僵直

  

CNS，感觉，自主神经

   

G.

  

异常运动: 痉挛，足尖步态，踏步，忙碌，低伏

  

CNS，感觉，神经肌肉

   

H.

  

俯卧：不移动，腹部贴地

  

CNS，感觉，神经肌肉

   

I.

  

震颤：包括四肢和全身的颤抖和震颤

  

神经肌肉，CNS

   

J.

  

肌束震颤：包括背部、肩部、后肢和足趾肌肉的运动

  

神经肌肉，CNS，自主神经

   

III. 惊厥(发作)：随意肌明显的无意识收缩或惊厥性收缩

  

A.

  

阵挛性抽搐：肌肉收缩和松弛交替性痉挛

  

CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经

   

B.

  

强直性抽搐：肌肉持续性收缩，后肢僵硬性伸展

  

CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经

   

C.

  

强直性-阵挛性抽搐：两种类型抽搐交替出现

  

CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经

   

D.

  

窒息性抽搐：通常是阵挛性抽搐并伴有喘息和紫绀

  

CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经

   

E.

  

角弓反张:背部弓起、头向背部抬起的强直性痉挛

  

CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经

   

IV. 反射

  

A.

  

角膜性眼睑闭合：接触角膜导致眼睑闭合

  

感觉，神经肌肉

   

B.

  

基本条件反射: 轻轻敲击耳内表面，导致外耳抽搐

  

感觉，神经肌肉

   

C.

  

正位反射：翻正反射的能力

  

CNS，感觉，神经肌肉

   

D.

  

牵张反射：后肢被牵拉至从某一表面边缘掉下时收回的能力

  

感觉，神经肌肉

   

E.

  

光反射(瞳孔反射)；见光瞳孔收缩

  

感觉，神经肌肉，自主神经

   

F.

  

惊跳反射：对外部刺激(如触摸、噪声)的反应

  

感觉，神经肌肉

   

V. 眼检指征

  

A.

  

流泪：眼泪过多，泪液清澈或有色

  

自主神经

   

B.

  

缩瞳：无论有无光线，瞳孔缩小

  

自主神经

   

C.

  

散瞳：无论有无光线，瞳孔扩大

  

自主神经

   

D.

  

眼球突出：眼眶内眼球异常突出

  

自主神经

   

E.

  

上睑下垂：上睑下垂，针刺后不能恢复正常

  

自主神经

   

F.

  

血泪症：眼泪呈红色

  

自主神经，出血，感染

   

G.

  

瞬膜松弛

  

自主神经

   

H.

  

角膜浑浊，虹膜炎，结膜炎

  

眼睛刺激

   

VI. 心血管指征

  

A.

  

心动过缓：心率减慢

  

自主神经，肺心功能不全

   

B.

  

心动过速：心率加快

  

自主神经，肺心功能不全

   

C.

  

血管舒张：皮肤、尾、舌、耳、足垫、结膜、阴囊发红，体热

  

自主神经、CNS、心输出量增加，环境温度高

   

D.

  

血管收缩：皮肤苍白，体凉

  

自主神经、CNS、心输出量降低，环境温度低

   

E.

  

心律不齐：心律异常

  

CNS、自主神经、肺心功能不全，心肌梗塞

   

VII.流涎

  

A.

  

唾液分泌过多：口周毛发潮湿

  

自主神经

   

VIII. 竖毛

  

A.

  

毛囊竖毛组织收缩导致毛发蓬乱

  

自主神经

   

IX. 痛觉缺失

  

A.

  

对痛觉刺激（如热板）反应性降低  

  

感觉，CNS

   

X. 肌张力

  

A.

  

张力低下：肌张力全身性降低

  

自主神经

   

B.

  

张力过高：肌张力全身性增高

  

自主神经

   

XI. 胃肠指征

  

  

  

   

  排便(粪)

  

A.

  

干硬固体，干燥，量少

  

自主神经，便秘，胃肠动力

   

B.

  

体液丢失，水样便

  

自主神经，腹泻，胃肠动力

   

       呕吐

  

A.

  

呕吐或干呕

  

感觉，CNS, 自主神经(大鼠无呕吐)

   

       多尿

  

A.

  

红色尿

  

肾脏损伤

   

B.

  

尿失禁

  

自主感觉神经

   

XII. 皮肤

  

A.

  

水肿：液体充盈组织所致肿胀

  

刺激性，肾功能衰竭，组织损伤，长时间静止不动

   

B.

  

红斑：皮肤发红

  

刺激性，炎症，过敏

（二）不同情况的中药、天然药物单次给药毒性试验的要求

由于中药、天然药物的特殊性，在具体进行试验时可参照以下要求进行；如不按以下要求进行，应充分说明理由。

1．未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效成分及其制剂，新发现的药材及其制剂，新的中药材代用品、药材新的药用部位及其制剂，未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效部位制成的制剂，未在国内上市销售的中药、天然药物注射剂。

以上情况，由于其物质基础较传统中药发生了明显改变，或应用经验较少，一般采用啮齿类和非啮齿类两种动物，全面考察受试物的急性毒性反应情况。如不按以上要求进行，应说明理由。

2．未在国内上市销售的非注射给药的中药、天然药物复方制剂。

如该复方制剂处方组成符合中医药理论，有一定的临床应用经验，一般情况下，可采用一种动物、按临床拟用途径进行急性毒性反应的观察。

如该复方制剂为天然药物复方制剂，建议采用啮齿类和非啮齿类两种动物，按临床拟用途径进行急性毒性反应的观察；如不按以上要求进行，应阐明其合理性。

如以上制剂处方中含有天然药物、有效成份或化学药品，则应当对上述药用物质进行急性毒性的相互作用研究。

3．改变国内已上市销售中药、天然药物给药途径（不包括由非注射剂改为注射剂）的制剂。

可仅采用一种动物，比较改变前后两种不同给药途径的急性毒性反应。

4．改变国内已上市销售药品剂型或改变生产工艺但不改变给药途径的中药、天然药物复方制剂。

如生产工艺的改变会引起物质基础的明显改变，或对药物的吸收、利用可能产生明显影响，建议采用一种动物，按临床拟用途径比较改变前后的急性毒性反应。

5．增加新的适应症或者功能主治的品种。

如需延长用药周期或增加剂量者，应结合原有毒理学资料及处方组成等情况确定是否需进行急性毒性试验，以及急性毒性试验的内容。

九、著者

《药物单次给药毒性试验技术指导原则》课题研究组。