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指导原则编号： 药物重复给药毒性试验 技术指导原则 （征求意见稿） 二○一三年五月 目 录 一、概述..................................................... 2 二、基本原则................................................ 2 三、基本内容 （一）受试物.............................................. 2 （二）实验动物............................................ 3 （三）给药方案............................................ 3 （四）指标 检测和检查...................................... 5 （五）毒物代谢动力学...................................... 6 四、结果分析和评价 （一）研究结果的分析...................................... 7 （二）动物毒性反应对于临床试验的意义..................... 8 （三）综合评价........................................... 9 五、参考文献................................................ 9 六、附录 （一）试验期限........................................... 10 （二）检测指标........................................... 11 七、注释 （一）不同情况的中药、天然药物重复给药毒性试验的要求..... 12 （二）中药毒性药材品种................................... 13
一、概述 重复给药毒性试验描述动物重复接受受试物后的毒性特征，它是非临床安全性评价的重要内容。通过重复给药毒性试验可以：①预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效关系和时效关系、可逆性等；②判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织；③推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；④提示临床试验中需重点监测的指标；⑤提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 《药品注册管理办法》明确规定药物非临床研究必须执行药物非临床研究质量管理规范。药物重复给药毒性试验是药物研发体系的有机组成部分，试验设计既要重视与其它药理毒理试验设计和结果的关联性、关注同类药物临床使用情况、临床适应证和用药人群、临床用药方案内容，还要结合受试物的理化性质和作用特点，使得试验结果与其它药理毒理试验互为说明、补充或/和印证。 三、基本内容 （一）受试物： 中药、天然药物：受试物应能充分代表临床试验样品或上市药品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、规格及生产单位。 化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。试验中所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产单位，并符合试验要求。 在药品研发过程中，若受试物的生产工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。 （二）实验动物： 重复给药毒性试验通常采用两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类。理想的动物应具有以下特点：①对受试物的生物转化与人体相近；②对受试物敏感；③已有大量历史对照数据。在重复给药毒性试验前应采用体外试验体系对实验动物的种属或品系进行筛选。特殊情况下可选用特殊种属或品系的动物进行重复给药毒性试验；必要时，也可选用疾病模型动物进行试验。 一般选择正常、健康和雌性未孕的动物，体重差异应在平均体重的20%之内；符合国家有关实验动物规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。 应根据试验期限的长短和受试物临床应用的患者人群确定动物的年龄。动物年龄应尽量一致，一般大鼠为6～9周龄，Beagle犬6～12月龄。 每个试验组动物数，一般大鼠为雌、雄各不少于15只，Beagle犬或猴为雌、雄各不少于5只。 此处删除了每组通常使用雌雄相同的动物数，有很多采用不对称设计的情况。是否合理？ （三）给药方案 1、 给药剂量：重复给药毒性试验至少应设3个给药剂量组，以及1个溶媒（或辅料）对照组，必要时设立空白对照组和/或阳性对照组；高剂量原则上使动物产生明显的毒性反应，低剂量原则上高于动物药效学试验的等效剂量、并不使动物出现毒性反应，结合毒性作用机制和模式在高剂量和低剂量之间设立中剂量，以考察毒性反应剂量-反应关系。 以上仅是剂量设计的一般原则，选择剂量应考虑之前进行的各项研究所评价的终点、受试物物理化因素和生物利用度等；应结合实际情况进行剂量设计，如出现未预期的毒性反应或不出现毒性反应时，可在设计更长时间的重复给药毒性试验时适当调整剂量；应根据动物生长和体重的变化情况而调整给药剂量；局部给药应尽可能保证给药剂量的准确及与给药局部接触时间的充分。 高剂量出现明显毒性反应，避免刻意追求暴露水平；可将系统暴露量达到临床系统暴露量50倍（基于AUC）的剂量作为重复给药毒性试验的高剂量。如在试验中途需要改变给药剂量，应完整描述剂量调整过程，依据给药剂量设计原则并使试验结束时动物数满足评价要求。 2、给药途径：原则上应与临床拟用途径一致；如不一致则应提供相关药理或药代/毒代依据，以及对给药部位影响的评价。 3、给药频率：原则上重复给药毒性试验中动物应每天给药，给药期限长的药物每周至少应给药6天。特殊类型的受试物由于其毒性特点和临床给药方案等原因，可根据具体药物的特点设计给药频率。 4、给药期限：重复给药毒性试验的给药期限通常与拟定的临床疗程、临床适应证和用药人群有关，给药时间与支持预期临床的实际疗程相关。一般药物的重复给药毒性试验给药期限，参考附录（一）。 通过较短给药期限的毒性研究获得的信息，可以为较长给药期限的毒性研究设计提供给药剂量、给药频率、观察指标等方面的参考；同时，临床试验中获得的信息有助于设计较长给药期限的动物毒性研究方案，降低药物开发的风险。以不同给药期限的重复给药毒性试验来分别支持不同用药期限的临床试验及上市评价时，不同给药期限的重复给药毒性试验内容应完整、规范，结果分析评价强调客观性、注重科学性。当拟临床研究的适应症有若干项，应按临床最长疗程的适应症来确定重复给药毒性试验的给药期限。 重复给药毒性试验必须检测的指标详见附录（二）。除必需的检测指标外，还应根据受试物的特点、在其他试验中已观察到的某些改变或其他的相关信息（如处方中组成成分有关于毒性的文献报道），增加相应的观察和检测指标。 应在试验结束时进行一次全面检测，当给药期限较长时，应根据受试物的特点选择合适的时间进行中期阶段性的检测；试验期间对濒死或死亡动物应及时取到标本进行观察和组织学检查，分析濒死或死亡的原因；恢复期结束时进行一次全面的检测。 给药前，对动物进行适应性饲养，啮齿类动物至少应进行5天的适应性观察，非啮齿类动物至少应驯养观察2周。对实验动物进行外观体征、行为活动、摄食量和体重检查，非啮齿类动物至少应进行2次体温、血液学和血液生化学等指标和至少1次心电图的检测。另外，实验动物相关指标的历史背景数据在重复给药毒性试验中也具有重要的参考意义。 给药期间，对动物进行外观体征、行为活动、摄食量、体重、眼科检查、腺体分泌、呼吸、粪便性状、给药局部反应、血液学指标、血液生化学指标等的观测。非啮齿类动物应进行体温、心电图、尿液分析；根据试验周期的长短和受试物的特点确定检测时间和检测次数。原则上应尽早发现毒性反应，并反映出观测指标或参数的变化与给药期限的关系。大鼠体重应雌雄分开进行计算。（与上面重复了，故删除）。 给药结束，对动物（除恢复期观察动物）进行全面的大体解剖，称重主要脏器并计算脏器系数；进行组织病理学检查并出具病理学检查报告，如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。非啮齿类动物对照组和各给药组主要脏器组织均应进行组织病理学检查；啮齿类动物对照组和高剂量组动物，以及尸检异常动物应详细检查，如高剂量组某一组织发生病理改变，应对其它剂量组的动物相同组织进行组织病理学检查。通常需要制备骨髓涂片，以便当受试物可能对造血系统有影响时进一步进行骨髓的检查。 在给药结束后对部分动物进行恢复期观察，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。应根据受试物的代谢动力学特点、靶组织或靶器官的毒性反应和恢复情况确定恢复期的长短。 （五）毒物代谢动力学 重复给药毒性试验应伴随进行考察药物系统暴露的毒物代谢动力学研究。毒代动力学可以描述实验动物的系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系，毒代动力学研究的主要目的在于解释重复给药毒性试验的结果。毒代动力学试验应选择合适的时间点采样测定，从而获得药时AUC、Cmax、Tmax等参数。某些药物应结合药物血浆蛋白结合率来评价系统暴露量；毒代动力学数据可以来自重复给药毒性试验的全部动物或部分动物，还可以来自卫星组动物。建议此部分动物应包括高、中、低剂量组的动物，以便估算高剂量药物在动物体内的动力学过程是否属非线性动力学过程。 四、结果分析和评价 重复给药毒性试验的最终目的在于预测人体可能出现的毒性反应。只有通过研究结果的科学分析和评价才能够清楚描述动物的毒性反应，并推断其与人体的相关性。重复给药毒性试验结果的分析和评价是重复给药毒性试验的必要组成部分，必须对研究结果进行科学和全面的分析和评价。 （一）研究结果的分析 分析重复给药毒性试验结果的目的是判断动物是否发生毒性反应，描述毒性反应的性质和程度（包括毒性起始时间、程度、持续时间以及可逆性等）和靶器官，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。 1、正确理解试验数据的意义 在对重复给药毒性试验结果进行分析时，应正确理解均值数据和单个数据的意义。啮齿类动物重复给药毒性试验中组均值的意义通常大于单个动物数据的意义，实验室历史背景数据和文献数据可以为结果的分析提供参考。非啮齿类动物数量少、个体差异大，因此单个动物的试验数据往往具有重要的毒理学意义。此外，非啮齿类动物试验结果必须与给药前数据、对照组数据和实验室历史背景数据进行多重比较，文献数据参考价值有限。在分析重复给药毒性试验结果时应综合考虑数据的统计学意义和生物学意义。正确利用统计学假设检验有助于确定试验结果的生物学意义，但具有统计学意义并不一定代表具有生物学意义。在判断生物学意义时应考虑到参数变化的剂量-反应关系、其他相关参数的改变，以及与历史背景数据的比较。 此外，在对重复给药毒性试验结果进行分析时，应对异常数据进行合理的解释。 2、正确判断毒性反应 给药组和对照组之间检测参数的差异可能来自于与受试物有关的毒性反应、动物对药物的适应性改变或正常的生理波动。在分析试验结果时，应关注参数变化的剂量－反应关系、组内动物的参数变化幅度和性别差异，同时综合考虑多项毒理学指标的检测结果，分析其中的关联和作用机制，以正确判断药物的毒性反应。单个参数的变化往往并不足以判断化合物是否引起毒性反应，可能需要进一步进行相关的研究。此外毒代动力学研究可以为毒性反应和毒性靶器官或靶组织的判断提供重要的参考依据。 （二）动物毒性反应对于临床试验的意义 将重复给药毒性试验结果外推至人体时，不可避免地会涉及到受试物在动物和人体内毒性反应之间的差异。首先，不同物种、同物种不同种属或个体之间对于某一受试物的毒性反应可能存在差异；其次，由于在重复给药毒性试验中通常采用较高的给药剂量，受试物可能在动物体内呈非线性动力学代谢过程，从而导致与人体无关的毒性反应；另外，重复给药毒性试验难以预测一些在人体中发生率较低的毒性反应或仅在小部分人群中出现的特异质反应；同时有些毒性反应目前在动物中难以检测，如头痛、头昏、头晕、腹胀、皮肤搔痒、视物模糊等。鉴于以上原因，动物重复给药毒性试验的结果一般不会完全再现于人体临床试验。但如果没有试验或文献依据证明受试物对动物的毒性反应与人体无关，在进行药物评价时必须首先假设人最为敏感，重复给药毒性试验中动物的毒性反应将会在临床试验中再现。进行深入的作用机制研究将有助于判断动物和人体毒性反应的相关性。 （三）综合评价 重复给药毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的结果，进行综合评价。对于重复给药毒性试验结果的评价最终应落实到受试物的临床不良反应、临床毒性靶器官或靶组织、安全范围、临床需重点检测的指标，以及必要的临床监护或解救措施。 五、参考文献 1、化学药物长期毒性试验技术指导原则. 国家药品监督管理局，2005.3. 2、中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则. 国家药品监督管理局，2005.3. 3、周宗灿. 毒理学基础. 第二版. 北京医科大学出版社，2000. 4、秦伯益. 新药评价概论. 第二版 人民卫生出版社，1998. 5、Guidance on nonclinical safety studies for the conductof human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals , ICH /M3(R2) 2009.6 6、Guideline on repeated dose toxicity, EMA 2010.3 7、Redbook 2000 IV.C, FDA 2003、2007 六、附录 （一）重复给药毒性试验期限 支持药物临床试验 支持药物上市 1．非啮齿类动物不超过6个月期限的试验可接受情况：（这两部分我没有仔细看。） ·当免疫原性或耐受性问题使更长期限的试验难以进行时； ·重复、短期用药（即便临床试验期限6个月以上）的疾病，如偏头痛、勃起障碍、单纯性疱疹的反复间歇给药时； ·拟用于危及生命的疾病（如进展性疾病、辅助使用的肿瘤化疗药）时。 2． 用药人群为儿童时，已有的毒性试验不能充分说明对毒理学或药理学靶器官发育的担忧，需要进行非啮齿类幼年动物的重复给药毒性试验。这种情况下，能说明此种发育担忧的、在合适的起始年龄和种属幼年动物上进行重复给药毒性试验（如期限为12个月的犬试验）是合适的；这项试验可以代替标准的非啮齿类动物重复给药毒性试验和单独的非啮齿类幼年动物重复给药毒性试验。 （二）检测指标（将来最好用表格。） 1、血液学指标：红细胞计数、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、网织红细胞计数、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血酶原时间； 2、血液生化学指标：天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、γ-谷氨酰转移酶、钾离子浓度、氯离子浓度、钠离子浓度； 3、尿液分析指标：尿液外观、比重、pH值、尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、白细胞； 4、组织病理学检查的脏器组织 ⑴需称重并计算脏器系数的器官：脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸、附睾、卵巢、子宫、甲状腺和甲状旁腺； ⑵需进行组织病理学检查的组织或器官：肾上腺、主动脉 骨（股骨）、骨髓（胸骨）、脑（至少3个水平）、盲肠、结肠、子宫和子宫颈、十二指肠、附睾、食管、眼、胆囊（如果有）、哈氏腺（如果有）、心脏、回肠、空肠、肾脏、肝脏、肺脏（附主支气管）、淋巴结（一个与给药途径相关，另一个在较远距离）、乳腺、鼻甲、卵巢和输卵管、胰腺、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、坐骨神经、精囊（如果有）、骨骼肌、皮肤、脊髓（3个部位：颈椎、中段胸椎、腰椎）、脾脏、胃、睾丸 胸腺（或胸腺区域）、甲状腺/甲状旁腺 气管 膀胱、阴道、所有异常组织。 七、注释 （一）不同情况的中药、天然药物重复给药毒性试验的要求 考虑到中药、天然药物各类药物处方来源、立题依据等的不同，在具体进行试验时可参照以下要求进行。但这些要求仅是一般要求，研制者应遵循新药开发的客观规律，具体试验时应根据受试物自身特点、具体情况来进行设计，考虑需进行哪些研究。 1．未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效成分及其制剂，新发现的药材及其制剂，新的中药材代用品、药材新的药用部位及其制剂，未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效部位制成的制剂，未在国内上市销售的中药、天然药物注射剂。以上情况，由于其物质基础较传统中药发生了明显改变，或应用经验较少，为全面考察受试物的重复给药毒性反应情况，应采用啮齿类和非啮齿类两种动物进行重复给药毒性试验。 2．未在国内上市销售的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂中药的非注射给药的复方制剂可先进行一种动物（啮齿类）的重复给药毒性试验，当发现明显毒性时，为进一步研究毒性情况，再采用第二种动物（非啮齿类）进行研究。若该类处方中含有毒性药材（见附录原中药指导原则中具体解释）、无法定标准药材或有十八反、十九畏（删除）等配伍禁忌时，则应进行两种动物（啮齿类和非啮齿类）的重复给药毒性试验。天然药物组成的非注射给药的复方制剂临床试验前采用啮齿类和非啮齿类两种动物进行重复给药毒性试验。 3．改变国内已上市销售药品给药途径（不包括由非注射剂改为注射剂）的制剂、不改变给药途径的非注射给药改剂型制剂和改工艺制剂，建议增设一个原给药途径、原剂型或原工艺的高剂量对照组，先进行一种动物（啮齿类）的重复给药毒性试验。如发现与原给药途径、原剂型或原工艺制剂不同的明显毒性反应或更严重的毒性反应，应进行另一种动物（非啮齿类）的重复给药毒性试验。 4．增加新的适应症或者功能主治的品种如需延长用药周期或增加剂量者，应结合原品种的申报资料及处方组成的情况，确定是否需进行重复给药毒性试验研究及重复给药毒性试验研究的内容。 （二）中药毒性药材品种 毒性药材：系指入国务院《医疗用毒性药品管理办法》的中药品种。即：砒石、砒霜、水银、生马钱子、生川乌、生草乌、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘虫、红娘虫、生甘遂、生狼毒、生藤黄、生千金子、生天仙子、闹羊花、雪上一枝蒿、红升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、红粉、轻粉、雄黄。 另外，凡在近年来发现的有毒性作用药材（原料）或在复方中含有明显有毒组份的均按毒性药材处理。 >��L?���#�����重点对人CYP3A4以及CYP1A2、CYP2B6进行评估。体外诱导试验可运用人肝细胞多次给药后相关mRNA表达和/或酶活性的变化进行评价。
创新药物非临床ADME研究还应该考虑到药物代谢酶和转运体基因多态性的存在、代谢酶与转运体之间的相互影响、主要代谢物（325%原药AUC）的清除机制及潜在的相互作用、人特异性代谢物的评估等。 8、物质平衡 在临床前和临床早期阶段，特别是毒性剂量和有效治疗剂量范围确定的情况下运用放射性标记化合物，可通过收集动物和人体血浆、粪、尿以及胆汁以研究药物的物质平衡。这些研究能够获得化合物的排泄速率和途径等资料，而且有助于代谢产物的性质鉴定，并通过有限的数据比较它们的体内吸收和分布特点。通过体外和动物样品中分离出的代谢产物可用作参比品用于临床和非临床的定量研究。同时，大鼠组织分布研究和动物胆管插管收集的胆汁能够提供药物的组织分布资料和明确胆汁清除特点。一般应采用放射性同位素标记技术研究物质平衡。有关试验方法的介绍及相关考虑见附录2。 考虑到每一个化合物及其代谢产物具有各自的理化特性，在开展不同化合物的同位素标记研究时对试验方法作慎重的修改是很有必要的。 四、数据处理与分析 应有效整合各项试验数据，选择科学合理的数据处理及统计方法。如用计算机处理数据，应注明所用程序的名称、版本和来源，并对其可靠性进行确认。 五、结果与评价 对所获取的数据应进行科学和全面的分析与评价，综合论述药物在动物体内的药代动力学特点，包括药物吸收、分布和消除的特点；经尿、粪和胆汁的排泄情况；与血浆蛋白结合的程度；药物在体内蓄积的程度及主要蓄积的器官或组织；如为创新性的药物，还应阐明其在体内的生物转化、消除过程及物质平衡情况。 在评价的过程中注意进行综合评价，分析药代动力学特点与药物的制剂选择、有效性和安全性的关系，从体外试验和动物体内试验的结果，推测临床药代动力学可能出现的情况，为药物的整体评价和临床研究提供更多有价值的信息。 六、参考文献 1、中华人民共和国卫生部药政局.《新药（西药）临床前研究指导原则汇编》. 1993年7月. 第39页~42页 2、郑筱萸.《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则（试行）》. 中国医药科技出版社，2002年5月. 第57~62页 3、ICH. S3B: Pharmacokinetics: guidance for repeated dose tissuedistribution studies. 1994 4、EMEA. 3BS11A: Pharmacokinetics and metabolic studies in the safetyevaluation of new medicinal products in animals. http://pharmacos.edura.org. 1994.4 5、秦伯益主编.《新药评价概论》(第二版). 人民卫生出版社. 1998年12月 7、国家药典委员会. 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则，《中华人民共和国药典2010年版附录（二部）》 8、FDA. Guidance for industry:Bioanalytical method validation，U.S. Department of Health and Human Services. 2001.5 9、Shah VP, Midha KK, Findlay JWA, et al.Bioanalytical method validation¾Arevisit with a decade of progress. PharmaceuticalResearch, 17: 1551-1557. 2000 10、USP 25. 2002 附录 附录1 生物样品分析方法的基本要求 1、基本概念 生物样品分析方法的基本参数包括：（1）准确度，（2）精密度，（3）特异性，（4）灵敏度，（5）重现性，（6）稳定性。现将相关的概念介绍如下： 准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。 精密度：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。 特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、基质组分等。 灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下限样品的准确度和精密度来表征。 重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。 稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基质中的化学稳定性。 标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。 提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。 定量范围：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。 生物基质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。 基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。 分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。 标准样品：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。 质控样品：即QC样品，系指在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。 2、生物样品分析方法的建立和确证 由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素影响生物样品测定，所以必须根据待测物的结构、生物基质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品分析方法，并对方法进行确证。 分析方法确证分为全面确证和部分确证两种情况。对于首次建立的生物样品分析方法、新的药物或新增代谢物定量分析，应进行全面方法确证。在其他情况下可以考虑进行部分方法确证，如生物样品分析方法在试验室间的转移、定量浓度范围改变、生物基质改变、稀少生物基质、证实复方给药后分析方法的特异性等。 应考察方法的每一步骤，确定从样品采集到分析测试的全过程中，环境、基质、材料或操作上的可能改变对测定结果的影响。 （1）特异性 必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察6个不同个体空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS、LC-MS/MS等），应注意考察分析过程中的基质效应，如离子抑制等。 （2）标准曲线与定量范围 根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法（如用加权最小二乘法）获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 用至少5个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物基质，定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。 （3）精密度与准确度 要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍或3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度，应至少3个分析批合格。 精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，相对标准差一般应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%。 准确度一般应在85%～115%范围内，在定量下限附近应在80%～120%范围内。 （4）定量下限 定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/10～1/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。 （5）样品稳定性 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。 （6）提取回收率 应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密和可重现。 （7）微生物学和免疫学分析 上述分析方法确证的很多参数和原则也适用于微生物学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以尽可能采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键的因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤。 3、生物样品分析方法的应用 应在生物样品分析方法确证完成之后开始测试未知样品。推荐由独立的人员配制不同浓度的标准样品对分析方法进行考核。 每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。药代动力学比较试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一分析批中测定。 每个分析批应建立标准曲线（组织分布试验时，可视具体情况而定），随行测定高、中、低3个浓度的质控样品，每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，最多允许1/3质控样品的结果超限，但不能在同一浓度中出现。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。 浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白基质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对AUC计算的影响。 4、分析数据的记录与保存 分析方法的有效性应通过试验证明。在分析报告中，应提供成功完成这些试验工作的相关资料。建立一般性和特殊性标准操作规程，保存完整的试验记录是分析方法有效性的基本要素。生物分析方法建立中产生的数据和QC样品测试结果应全部记录并妥善保存，必要时接受检查。 提供给药品注册管理部门的材料应当包括：（1）综合信息；（2）方法建立的数据；（3）在日常样品分析中的基本资料；（4）其他相关信息。 （1）综合信息 项目编号，分析方法编号，分析方法类型，分析方法确证简化的理由，以及相应的项目计划编号、标题等。 （2）方法建立的数据 分析方法的详细描述；该方法所用对照品（被测药物、代谢物、内标物）的纯度和来源；稳定性试验描述及相关数据；描述测定选择性、准确度、精密度、回收率、定量限、标准曲线的试验并给出获得的主要数据；列出批内、批间精密度和准确度的详细结果。根据具体情况提供代表性的色谱图或质谱图并加以说明。此外，尚需对所建立的方法学在实际分析过程中的优缺点进行评价。 （3）在日常样品分析中的基本资料 所用样品（受试物、代谢物、内标物）的纯度和来源。样品处理和保存的情况，样品编号、采集日期、运输前的保存、运输情况、分析前的保存。信息应包括日期、时间、样品所处条件，以及任何偏离试验计划的情况。样品分析批的综合信息，包括分析批编号、分析日期、分析方法、分析人员、开始和结束时间、主要设备和材料的变化，以及任何可能偏离分析方法建立时的情况。 用于计算结果的回归方程，分析样品时标准曲线列表，各分析批质控样品测定结果综合列表并计算批内和批间精密度、准确度，各分析批包括的未知样品，浓度计算结果。 提供20%受试物样品测试的色谱图或其他原始数据的复印件，包括相应分析批的标准曲线和质控样品的色谱图或其他原始数据的复印件。 注明缺失样品的原因，重复测试的结果。应对舍弃任何分析数据和选择所报告的数据说明理由。 （4）其他相关信息 缩略语列表，参考文献列表，标准操作规程列表。 附录2 应用放射性同位素标记技术进行药物非临床药代动力学研究 （待进一步修订） 新药研发过程中，了解候选药物在人体和用于毒理和药效研究的动物体内的变化情况至关重要。因此，在新药研发不同阶段必须进行各种体内体外药代试验以阐明候选药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）等性质。尽管液质联用技术已大量应用于这些试验，但放射性同位素标记技术仍被广泛使用。低能量放射性同位素（如14C，3H）标记化合物应用于药代动力学研究已有半个多世纪的历史。低能量放射性同位素生物界背景很低因而检测容易且灵敏、半衰期较长而不需根据放射性半衰期校正试验结果、可定量分析候选药物产生的代谢产物而不需知道它们的结构、产生的非离子化β-射线能量极低而不需特殊防护，被证明为一种安全有效的特殊技术，目前在多数情况下尚无别的取代方法。因其结果简单明了、被公认为药代动力学试验的“金标准”之一。 附录3 几个需要关注的问题 1、关于中药、天然药物药代动力学研究 在中药、天然药物新药研究开发的过程中，通过对活性成分或活性代谢物非临床药代动力学研究，了解其相关药代动力学参数，可作为阐明药效或毒性产生的基础及了解药效或毒性反应靶器官的依据，并为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 但中药活性成分情况较为复杂，有些活性成分较为单一，有些物质基础比较清楚但成分较多，有些活性成分复杂且不清楚。 对于活性成分单一的中药、天然药物，其非临床药代动力学研究与化学药物基本一致。 对于非单一活性成分但物质基础基本清楚的中药、天然药物，其中药效或毒性反应较强、含量较高的成分，一般需要进行药代动力学探索性研究。对于活性成分复杂且物质基础不太清楚的中药、天然药物，应根据对其中部分已知成分文献研究的基础上，重点考虑是否进行有明确毒性成分的非临床药代动力学研究。若有足够证据表明某类结构相似的一类成分中某一个成分的药代动力学属性可以代表该类成分的药代动力学特征，可从同类成分中选择一个代表性成分进行测定。被测成分应根据机体的暴露水平和暴露形式，以及药效作用/安全性相关性等因素来确定。 此外，在进行中药、天然药物非临床药代动力学研究时，应充分考虑中药、天然药物所含化学成分不同于化学合成药物的特点，结合其特点选择适宜的方法开展体内过程或活性代谢产物的研究，为后续研发提供参考。若拟进行的临床试验中涉及到与其他药物（特别是化学药）联合应用，应考虑通过体外、体内试验开展药物相互作用研究。 2、关于药代动力学研究的体外方法 随着体外生物技术的发展，不少药代动力学的体外方法有效地应用于药物代谢和相互作用评价，如体外吸收模型（Caco-2细胞模型）、体外肝系统研究、体外转运系统等。这些体外方法学在推测人药代动力学参数和特征时，提供了同种属的体外到体内的推测。体外方法学可以通过应用不同辅酶、不同选择性抑制物，不同重组基因纯酶，在试验设计上，可以弥补动物体内方法学的缺陷。人和动物的体外方法学结合动物的体内方法学，在新药研发的临床前阶段，可以较准确和有效地评价药物的吸收、运转、分布、代谢，比如药物代谢产物鉴定、代谢途径鉴定、药物对代谢酶和转运体的抑制和诱导等，为阐明药理和毒理作用机制和设计第一个临床研究剂量和评价潜在性药物代谢性或运转性相互作用提供可靠的参数。药代动力学的体外方法学的应用，在不影响或优化临床前研究信息量的同时，减少了实验动物的使用，使动物伦理学的实施逐渐成为可行。 对于体外研究发现有明显种属差异的的药物，应进一步分析解释。 3、关于动物选择 由于动物药代动力学研究是联系动物研究与人体研究的重要桥梁，动物选择的恰当与否是该研究价值大小的关键。应尽量选择适宜的动物来进行研究，如口服给药的药物不宜选择食草类动物或与人胃肠道情况差异较大的动物，以免由于吸收的差异造成试验结果不能充分提示临床。对于创新性的药物，可利用体外药代动力学手段预先对动物种属进行筛选，以选择药物动力学特点与人体最接近的动物，提高试验结果的临床预测价值。由此也可为毒性试验选择合适的动物种属提供依据，并对毒性试验与人体的相关性做出判断。 4、关于手性药物 对映异构体具有几乎相同的物理性质（旋光性除外）和化学性质（在手性环境中除外），通常需要特殊的手性技术对它们进行鉴定、表征、分离和测定，但生物系统常常很容易区分它们，并可能导致不同的药代动力学性质（吸收、分布、代谢、排泄），以及药理学、毒理学效应的量或质的区别。 为评价单一对映体或对映体混合物的药代动力学，研究者应在药物开发前期，建立适用于体内样品对映体选择性分析的定量方法，为后期研究对映体之间的相互转化以及各自的吸收、分布、代谢和排泄提供方法学基础。 如果外消旋体已经上市，研究者希望开发单一对映体，则应测定该对映体转化为另一对映体的程度是否显著，以及该对映体单独用药是否与其作为外消旋体组分时的药代动力学性质一致。 为监测对映异构体在体内的相互转化和处置，应获得单一对映体在动物体内的药代动力学曲线，并与其后在临床I期试验中获得的药代动力学曲线相比较。 5、关于复方制剂 对于新的复方制剂，应通过复方与单药药代动力学的比较，研究其相互作用，以考察组方的合理性。
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发表于 2014-7-3 08:53:03
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