全国药品微生物检验及控制技术高级研修班-培训总结（2014年第二期）免费下载

小城事多

三 洁净监测技术及《中国药典》2015版洁净监测指导原则解析-张亚杰
1. 《中国药典》2015版洁净监测指导原则 只适用于药品分析实验室
2. 指导原则不是强制性附录（分前言、人员、确认、监测、微生物控制五部分）
3.各级别洁净环境物理参数建议标准及最长监测周期
洁净度
级别        过滤完整性        气流组织        空气流速        换气次数        压差        温度        相对湿度
A        检漏实验监
测周期
24个月        单向流
监测周期
24个月        0.25-0.5m/s
监测周期
12个月        ——        洁净区与非洁净区之间≥10Pa
不同洁净区之间压差≥10Pa

监测周期每周一次        20-24℃
监测周期
每次试验        45-65%
监测周期
每次试验
B                ①        单向流（静态）监测周期24个月
②        非单向流
——        ①单向流（静态）0.25-0.5m/s
监测周期
12个月
② 非单向流
  ——        ①单向流
——
③        非单向流
④        40-60h-
监测周期12个月1                       
C                非单向流
——                20-40h-
监测周期
12个月                       
D                非单向流
——                6-20h-
监测周期
12个月                       
4.监测所用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），当监测结果有意思真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）。
  培养时间对比表                                  15版药典后环境监测碟培养至少3天
名称        ChP（2015）        GB/T 16293-2010
TSA        3天        不少于2天
SDA        5天        不少于5天
       建议：生产过程也适当延长沉降菌碟的培养时间。
5.P78 表2 推荐的药品洁净实验室的监测频次及项目（菌检室人员重点看）
6.无历史数据的实验室浮游菌、沉降菌警戒限、纠偏限制定（P80）
7.建议对受控微生物环境的微生物进行到“种”水平的检测，且关键区域分离的菌落优先鉴定。
8.微生物监测的重要性-P95（扫描页）
9.目前悬浮粒子监测方法（光散射发-常用、光衍射法、光学显微镜法）：悬浮粒子数是洁净环境定级的依据（其它如浮游菌、沉降菌等均为该级别的监测指标）
  仪器的校准：应符合JJF 1190-2008的标准
10.浮游菌监测：采样器主要有被动沉降类、动力分离类、其他类别（国标法采用的是狭缝式、离心式或真空式动力分离原理）；选择采集器时应注意灵敏度、采样效率、可重复性、使用方便、利于微生物存活等特性
11.浮游菌监测时应注意，采样器消毒后先不放入培养皿，开启仪器至少5min后，使消毒剂完全蒸发后采集。
12.沉降菌：
12.1 用于环境监控的培养基须特别防护，最好双层包装和终端灭菌，如不能终端灭菌，那么在使用前应进行100%预培养以防止外来污染物带入环境中及避免出现假阳性。
12.2沉降菌碟暴露失水会导致降低某些微生物的生长能力，研究表明，单向流暴露4小时，平板失重16%；故而最后选择1~2小时更换一次，累积计数。
12.3 进入A级的平板，三层透明包装是最合适的。
12.4进入隔离器的平板其最内层包装必须是过氧化氢蒸汽不可渗透的，以免假阴性。应使用为隔离器设计的培养基平板。
12.5日常监测：老师的建议是每次、每个区域都要有阴性对照；A级区域采样点数目不小于3个且每个点平皿数不小于一个。
13表面微生物监测后，应使用消毒剂或杀孢子剂擦拭以清除培养基的残留。
14.表面微生物监测方法验证时应注意取样回收率应在50%-200%范围内，各种表面均应在生物安全柜内被模拟；计数方法验证应考虑抑菌成分的影响。

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四 无菌药品生产过程中的微生物控制及验证要素-马义岭
1.药物污染及降低风险举例（P131）
2.关键区域人员的验证要素（人员更衣验证、无菌操作模拟验证、消毒剂效果验证、人员表面微生物监测、定期无菌操作模拟、无菌操作考核）
3.更衣程序验证策略（P145）
4.洁净室的灯光照明系统宜采用内嵌至棚顶的吸灯，和棚顶同面，利于清洁。
5.设备微生物污染示例（P154）
6.制药用水微生物限度参考值（表中把各种水都定了警戒、纠偏，并进行定期监测）P157
7.建立菌落地图的方法（P161）
8.消毒剂选择（P169）
9.消毒剂应有微生物负荷检验、质量标准、检验报告
10.USP 1072 适用于生产环境的消毒剂相关内容分析（P177）
11.国内消毒剂验证可参考的标准： GB 15981-1995 第三篇 液体消毒剂消毒效果评价方法与标准
12.建议洁净室的清洁、消毒应采用“双桶法”。
13.介绍了微生物在线检测技术（传统的缺点、在线检测原理、系统验证）、环境监测系统的组成

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五、无菌检查及疑似结果的溯源性调查-戴翚
1.洁净室使用次数与浮游菌的关系（6~8月微生物繁殖旺盛是之一，还有近三年开始的国抽集中在这段时间检验，使用频率增大、样品增多等原因）
2.环境微生物归属方法（附件2）
3.感染性微生物相对危险度等级：2级（配备生物安全柜 II A2即可），A2生物安全柜结构图（P216）
4.隔离器与传统洁净技术的比较（P221）
5.微生物实验室常用菌株（附表3）
6.两个说法：G-球菌一般在医疗中的人感染分离出来；G+球菌一般在实验室、空气介质中常见（非观点）   G-杆 水、液态药液……
7.微生物检验的方法适用性试验（微生物检验方法的验证试验涉及较多方面内容，企业只需要进行检验方法的适用性确认）
① 样品制备过程（表面活性剂、中和剂的微生物无毒性、处理方法的微生物兼容性）
②样品检查过程（可用的去除活性或中和活性的方法）
新建方法              →方法验证与方法适用性
药典方法              →方法转移与方法确认
（其他成熟方法）      （ 部分菌株的验证）
有案可查、溯源性；建立实验室自身的方法依据体系
其它：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、粗放性
8.常用中和剂（0.1%大豆卵磷脂、0.7%吐温80）
  卵磷脂、吐温及L-组氨酸用于中和醛类、酚类及季铵盐类化合物
  卵磷脂中和氯已定，吐温80中和双三氯酚及汞化合物
9.表面活性剂HLB值越接近20，其亲水性越强；相反，越接近于0，亲油性越强
10. 薄膜过滤法冲洗时，最好采用分次（100ml/次）的方法，以提高方法的回收率（P234）
11.菌种传代推荐保存方式：-80℃，甘油：肉汤=1:1或者甘油：TSA=1:1的1~1.5ml冻存管保存。
  应选取增殖体（调整期、对数期、稳定期、衰亡期）。
0.5麦氏浊度的相当于106CFU，可比例稀释得到102悬液。
12.菌种从保藏中心获得0代后，第一代就可以用作工作菌株（WHO的规定）。
13.可参考的工作菌株保藏流程图（P235）。
14.建议使用无菌级过氧乙酸喷雾手消器。
15.三联集菌器较合适，最多浪费一桶（两个阴性、两个样品、一个或两个阳性桶）。
16.原始记录列好下列信息：
  样品信息（表头）&方法信息、仪器信息及状态、检验结论（前置，便于核对）、校对&复核信息（前置）、材料信息、试剂信息、培养基信息、检验方法/过程描述、检验结果记录、过程监控信息（监控方案、培养调剂、培养结果）、是否有偏差及变更等
  偏差调查表包含：样品信息、环境保障调查、仪器运转、环境监控、检验操作调查、培养基、检验用具、阴性、阳性、操作细节、结果判断调查等。
17.结果判断
          前提：阳性必须显示阳性反应，阴性必须无菌生长。
供试管浑浊，即判定不合格
除非能证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含，如：
设备、环境的微生物监测结果超标，分离得到同属菌
回顾实验过程，发现污染因素
鉴定微生物确认是操作引入的
无菌试验经确认无效，可以重试。

18. 葡糖糖酸钙注射液与氯化钠注射液 安瓿表面杆菌污染案例（p243）引申，外表消毒方式表
安瓿表面消毒方案比较表
a.        杀孢子剂（过氧乙酸）喷洒后立即（3、5、10min）用75%乙醇钝化，再用湿棉签擦拭取样
b.        酒精灯过火1s（3、5、10s）直接用湿棉签擦拭取样
消毒方案        作用时间        残留菌落数        菌属类型
杀孢子剂        立即        2cfu        Bacillus（杆菌）
        3min        0       
        5        0       
        10        0       
过火        1s        4        Bacillus（杆菌） Brevibacillus（短小芽孢杆菌）
        3        10        Bacillus（杆菌） Brevibacillus（短小芽孢杆菌）
Penibacillus（类芽孢杆菌）
        5        0       
        10        0       

实验表明，杀孢子剂具有较好的表面消毒能力，过火的经典方法应至少过火5s以上。
19.保证药品微生物检验结果可靠的有效途径及无菌溯源调查（决策图）


20.微生物警戒限与行动限的意义
  从污染微生物的种类、数量进行分析，了解环境情况的潜在的变化，及时分析原因，采取行动，使环境保持在要求的条件下。
a.        若微生物数量远低于警戒限，应考虑限值的合理性
b.        若微生物上升趋势明显，应考虑操作、清洁流程是否合理
c.        若微生物波动剧烈，应考虑多次操作之间的一致性
d.        若重复出现同样或相同类型的微生物，应考虑
评估消毒剂的有效性    评估清洁操作流程的合理性
21.欣弗事件污染了三种菌：不光灭菌参数的问题，检出了肺炎亚种，以及很小的黏质沙雷菌。
  洁净环境常见污染菌：头状葡萄球菌、溶血葡萄球菌、缓症链球菌、科氏葡萄球菌、藤黄微球菌、山羊葡萄球菌
22.微生物鉴定原则（P250）
23.常见微生物菌落特征（P251）
24.革兰氏阴性菌的KOH拉丝实验（P253）
25.细菌鉴定技术介绍（P255~262）
26.刺五加事件的真实结果（相关性，菌落鉴定局限性……），FDA的黑曲霉是巴西曲霉，根本不是黑曲霉，国家菌种保藏中心的才是。
27.中检院的药品污染鉴定方案（了解，P265 双黄连注射液事件）

小城事多

六、培养基质量控制及Ch.P 2015 微生物限度检查法---杨美琴
1.微生物检查的内容
  无菌、微生物限度（药品、pw、wfi）、抑菌效力、环境监控，后三者的结果是由培养基来实现富集和点计的。
2.提醒注意第三次意见稿
3.微生物限度检测法  计数法体系、控制菌培养基体系、、最大可能计数法、限度标准以指数计、不再规定复试而是结合实验室调查回顾分析结果的准确性
4.中和剂的选择方案（P287）
5.新方法规定的计数方法回收率（50%~200%）
6.计数方法实验注意事项（P289）
7.关于结果判断（演示，待正式版详解）
修订后，以指数形式表述标准，并以2倍因子进行控制，对结果判断有影响（检出能力高了，标准也“宽”了（统计学意义上讲更科学了））
例子：
样品        标准（cfu/g）        结论        结果1        结果2        结果3
样品1        霉菌及酵母菌数 100        合格~不合格        80        90        160
        TYMC         102        合格                       
样品2        细菌数         1000        不合格        1300        1500        1100

        TAMC          103        合格                       
102最大可接受限为200，103最大可接受限为2000，依次类推
8.计数方法适用性很关键（误差案例 P291）
9.计数方法本身有局限性（数越小误差越大）
USP36<1227>计数偏差： 25~30cfu/皿 RSD20%~18%
    细菌及酵母菌计数范围  25~250 cfu/皿   霉菌计数范围8~80 cfu/皿
10.7种控制菌检查中，梭菌和白念没有变化，其它5种有变化，使用无选择性增菌培养基（TSB）培养，使受损细菌得到修复，提高检出率。
11.关于大肠菌群（P295）
12.几个阳性菌的特点（P296~304）
13.包才的微生物控制水平、判断指标与药品不同（P317 菌检室重点学）
14.水微生物限度检查法（P319~326），介绍原理、培养基寡营养、研究对比、适用性检查
15.抑菌效力检查（略，验证主管、微生物主管自学）
16.培养基质量控制（P335~346）各种成分及目的或作用。
微生物实验室规划---马仕洪
1.        国内案例的启示
2.        新版药典的实施要求（药品微生物实验室规范指导原则 13要素）建设原则
3.        GMP实施理念转变   过程控制是重点，而不能仅靠最终检验，微生物实验室要想过程控制分析能力（微生物调查分析型实验室）的方向提高
4.        什么样的实验室（P355、P358、P361）
5.        金黄色葡萄球菌-葡萄球菌属-葡萄球菌科-芽孢杆菌目-芽孢杆菌纲-厚壁菌门-细菌域
提示企业要注重环境菌库（检验、生产）的建立、环境菌的鉴定能力的提高
6.        菌液获得方式（P373）
7.        OOS调查提示（P374~375）
8.        微生物鉴定水平（P379 表观<菌株采集、纯化  菌落、细胞形态观察 革兰氏染色 鞭毛动力>-生化<产气、产酸碱、分解酶、变色>-分子<PCR、糖链、红外、质谱、>）


附件1  微生物检验过程中的关键点过程控制


附件2  环境微生物归属流程图

附件3. 微生物实验室常用菌株

小城事多

以上内容是本帖附件内容，图片欠奉。公开多好，扩大交流，买一个这个，还要别人买，真受罪

xuhui758

怎么看不到内容

歪说歪有李

小城事多 发表于 2014-11-12 13:22
以上内容是本帖附件内容，图片欠奉。公开多好，扩大交流，买一个这个，还要别人买，真受罪

你的建议我收下了，下次发帖纠正，这次帖子不让改了，没有权限。。

歪说歪有李

小城事多 发表于 2014-11-12 13:22
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jjb2005

感谢分享，看来好评不少！

郭峰

这次没去参加新药典的培训，先在这学习下

善变的云

不错不错，谢谢分享

歪说歪有李

小城事多 发表于 2014-11-12 13:20
六、培养基质量控制及Ch.P 2015 微生物限度检查法---杨美琴
1.微生物检查的内容
  无菌、微生物限度（药品 ...

谢谢你顶贴，不过现在已经免费了。

布丁

大自然的搬运工，要滴要滴

布丁

顶贴赚积分啊~~~~~~~~~~

diqiang_pgy

附件看了，很不错，值得下载，期待后续大作

fqxiaopei

我想看看是不是有用

jkchenly

好好,很好的东东,长知识了.

kof081124

谢谢分享！！！！！！

kof081124

来看看什么好笔记。

513651459

听他们讲课是一种享受