洁净室(区)浮游菌测定标准操作规程

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1.目的：建立一个洁净室（区）浮游菌测定的标准操作规程，确保洁净室（区）洁净程度。

2.范围：适用于洁净室和洁净区、无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的浮游菌的测定和环境的验证。

3.责任：质量管理部QA监测员对本规程的实施负责。

4.程序：

4.1.术语和定义：下列术语和定义适用于本标准操作规程。

4.1.1.菌落 ：微生物培养后，由一个或几个微生物繁殖而形成的微生物集落，简称CFU。通常用个数表示。

4.1.2.浮游菌：用本标准操作规程提及的方法收集悬浮在空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。

4.1.3.浮游菌浓度：单位体积空气中含浮游菌菌落数的多少，以计数浓度表示，单位是个/m3或个/L。

4.1.4.纠偏限度：对于受控的洁净室（区），由使用者自行设定微生物含量等级。当检测结果超过该等级时，应启动监测程序对该区域的微生物污染情况立即进行跟踪。

4.1.5.警戒限度：对于受控制的洁净室（区），由使用者自行设定一个微生物含量等级，从而给定了一个正常状态相比最早警戒的偏差值。当超过该最早警戒的偏差值时，应启动保证工艺或环境不受影响的程序及相关措施。

4.2.测试方法

4.2.1.方法提要：本标准操作规程采用的方法是计数浓度法。即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基（选择能证实其能够支持微生物生长的培养基），经若干时间和适宜的生长条件让其繁殖到可见的菌落计数，以判定该洁净室的微生物浓度。

4.2.2.人员的职责及培训：洁净室（区）的测试人员应进行本专业的培训并获得相应资格后才能履行对洁净室（区）测试的职责，其中包含涉及的卫生知识和基本微生物知识。

洁净室（区）的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式。

4.2.3.仪器、辅助设备和培养基

选择合适的浮游菌采样器，包括采用无油的抽气泵，较低的气流流速和较大的采样流量，以保证培养基表面的水分不被吹干。

本测试需要具备仪器、辅助设备和培养基如下：

浮游菌采样器、培养皿、培养基（见本标准附录B）、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。

4.2.4.浮游菌采样器原理

浮游菌采样器一般采用撞击法机理，可分为狭缝式采样器、离心式或针孔式采样器。狭缝式采样器由内部风机将气流吸入，通过采样器的狭缝式平板，将采集的空气喷射并撞击到缓慢旋转的平板培养基表面上，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。离心式采样器由于内部风机的高速旋转，气流从采样器前部吸入从后部流出，在离心力的作用下，空气中的活微生物粒子有足够的时间撞击到专用的固形培养条上，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。针孔式采样器是气流通过一个金属盖吸入，盖子上市密集的经过机械加工的特制小孔，通过风机将收集到得细小的空气流直接撞击到平板培养基表面上，附着的活微生物粒子经培养后形成菌落。

本标准操作规程中使用的浮游菌采样器为狭缝式采样器。

4.2.5.测试要点

4.2.5.1.必须按照测试仪器的检定周期，定期对仪器作检定，使用校验合格，且在使用有效期内的仪器。

4.2.5.2.测试仪器在未进入被测区域时，若必需，则先清洁表面，或在相应的洁净室内准备和存放（用保护罩或其他适应当地外罩保护仪器）。

4.2.5.3.在A级洁净室内用纸时，上面应蒙上一张透明不沾尘的覆盖物，在A级洁净室内不能用铅笔和橡皮。

4.2.5.4.使用测试仪器时应严格按照仪器说明书操作。

4.2.5.4.1.仪器开机，预热至稳定后，方可按仪器说明书的规定对仪器进行校正，同时检查采样流量，并根据采样量设定采样时间。

4.2.5.4.2.采样口必须用便于消毒及化学性能稳定的材料制造。

4.2.5.4.3.采样管严禁渗漏，内壁应光滑。

4.2.5.4.4.采样管的长度应根据测点的高度定，尽量减少弯曲。

4.2.6.培养皿

4.2.6.1.一般采用∮90mm×15mm规格的培养皿。可根据所选用采样器选择合适的培养皿。

在本标准操作规程中采用∮150mm×15mm规格的培养皿

4.2.6.2.离心式采样器采用专用的固形培养条。

4.2.7.培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基(SDA)或其他用户认可并经验证了的培养基。其配制方法见附录B。

4.2.8.恒温培养箱：必须定期对恒温培养箱进行校验。

4.2.9.测试步骤

4.2.9.1.测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。

4.2.9.1.1.采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于 A级洁净室的采样宜预先放在被测房间内。

4.2.9.1.2.用消毒剂擦净培养皿的外表面。

4.2.9.1.3.采样前，先用消毒剂清洗采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。

4.2.9.1.4.采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。

4.2.9.1.5.采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒或戴无菌手套操作。

4.2.9.1.6.采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，并检查流量并根据采样量调整设定采样时间。

4.2.9.1.7.关闭浮游菌采样器，放入培养皿，盖上盖子。

4.2.9.1.8.置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。

4.2.10. 培养

4.2.10.1.全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。

4.2.10.2.采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基(SDA)配制的培养皿经采样后，在20℃~25℃培养箱中培养，时间不少于5d。

4.2.10.3.每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。

4.2.11.菌落计数

4.2.11.1.用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5~10倍的放大镜检查，有否遗漏。

4.2.11.2.若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。

4.2.12.注意事项

4.2.12.1.使用前应仔细检查每个培养皿的质量，培养基及培养皿有变质、破损或污染的不能使用。

4.2.12.2.对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。

4.2.12.3.由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落或培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。

4.3.测试规则

4.3.1.测试条件：在测试之前，要对洁净室（区）相关参数进行预先测试，这类测试将会提供测试悬浮粒子的环境条件，例如：这种预先测试或可包括：

4.3.1.1.温度和相对湿度的测试。洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时，温度在18℃~26℃，相对湿度在45％~65％为宜），同时应满足测试仪器的使用范围;

4.3.1.2.室内送风量或风速的测试，或压差的测试；

4.3.1.3.高效过滤器的泄露测试。

4.3.2.测试状态：静态和动态两种状态均可进行测试。静态测试时，室内人员不得多于2人。浮游菌测试前，被测洁净室（区）由使用者决定是否需要预先消毒。测试报告中应标明测试时采用的状态和室内测试人员数。

4.3.3.测试时间

4.3.3.1.在空态或静态a测试时，对单向流洁净室（区）而言，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于10min后开始。对非单向流洁净室（区），测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。在静态b测试时，对单向流洁净室（区），测试宜在生产操作人员撤离现在并经过10min自净后开始；对非单项流洁净室（区），测试宜在生产操作人员撤离现在并经过20min自净后开始。

4.3.3.2.在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。

4.3.4.浮游菌浓度计数

4.3.4.1.采样点数量及其布置

4.3.4.1.1. 最少采样点数目：

浮游菌测试的最少采样点数目可参照

4.3.4.1.2. 采样点的位置：

        浮游菌的采样点位置可参照。

4.3.4.1.2.1.工作区测点位置离地0.8m~1.5m左右（略高于工作面）；

4.3.4.1.2.2.送风口测点位置离开送风面20cm左右；

4.3.4.1.2.3.可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。采样点布置的规则见附录A。

4.3.4.2.最小采样量：浮游菌每次最小采样量见表1

                       表1  最小采样量

洁净度级别	采样量L/次
A级	1 000
B级	1000
C级	500
D级	100

4.3..4.3.采样次数：每个采样点一般采样一次。

4.3.4.4.采样注意事项

4.3.4.4.1.对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向;对于非单向流洁净室（区），采样口向上。

4.3.4.4.2.布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。

4.3.4.4.3.采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。

4.3.4.4.4.应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。

4.3.4.4.5.培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行阴性对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴漏采样，然后与采样后的培养皿（TSA或SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。

4.3.5.记录：测试报告应包含以下内容：

4.3.5.1.测试者的名称和地址，测试日期；

4.3.5.2.测试依据；

4.3.5.3.被测洁净室（区）的平面位置（必要时标注相邻区域的平面位置）；

4.3.5.4.有关测试仪器及其测试方法的描述：包括测试环境条件，采样点数目以及布置图，测试次数，采样流量，或可能存在的测试方法的变更，测试仪器的检定证书等；若为动态测试，则还应记录现场操作人员数量及位置，现场运转设备和数量和位置；

4.3.5.5.测试结果；包括所有统计计算资料。

4.3.6.计算结果

4.3.6.1.用计数方法得出各个培养皿的菌落数。

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps41E.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps41F.tmp.png4.3.6.2.每个测点的浮游菌平均浓度的计算，见式（1）。

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps420.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps421.tmp.png                                             ………………(1)

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps422.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps423.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps424.tmp.png       示例1：某测点采样量为400L，菌落数为1.则：

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps425.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps426.tmp.png                                          

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps427.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps428.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps429.tmp.png       示例2：某测点采样量为2 m3，菌落数为3，则：

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42A.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42B.tmp.png

4.3.7.结果评定：每个测点的浮游菌平均浓度必须低于所选评定标准中的界限。评定标准见表2 。

表2  洁净室区微生物监测的动态标准

项    目		A级	B级	C级	D级
浮游菌 cfu/ m3	合格限值	<1	10	100	200
	纠偏限值	0.75	7.5	75	150
	警戒限值	0.5	5	50	100
沉降菌（∮90mm） cfu/ 4h	合格限值	<1	5	50	100
	纠偏限值	0.75	3.5	35	75
	警戒限值	0.5	2.5	25	50
表面微生物 （∮55mm) cfu/皿	合格限值	<1	5	25	50
	纠偏限值	0.75	3.5	18	40
	警戒限值	0.5	2.5	12	25

5．变更历史

版本号	生效日期	变更原因、依据及详细变更内容
01	年  月  日	2010版GMP

附  录  A

洁净室（区）采样点布置

A1  洁净室（区）采样点布置宜力求均匀，避免采样点在某局部区域过于稀疏。下列采多点采样的采样点布置图示可作参考（见图A1）。

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42C.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42D.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42E.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps42F.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps430.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps431.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps432.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps433.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps434.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps435.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps436.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps437.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps438.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps439.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43A.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43B.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43C.tmp.pngfile:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43D.tmp.png                        

  注：·为采样点。          图A1  平面采样点布置图

A2  A级单向流区域，洁净工作台或局部空气净化设施的采样点宜布置在正对气流方向的工作面上，气流形式可参考图A2、A3

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43E.tmp.png              

图A2   水平单向流的气流形式

file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps43F.tmp.png

图A3   垂直单向流的气流形式

最少采样点数参见４.6.1.1.，采样点一般在工作台面上0.2m高度的平面上均匀布置。

                           附  录  B

                         （规范性附录）

培养基的灭菌及准备

B.1      大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）培养基的灭菌及准备

B1.1     培养基采用大豆酪蛋白琼脂培养基，可以按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后按培养基规定的经验证合格的灭菌程序灭菌。

B.1.2     大豆酪蛋白琼脂培养基配方

          酪蛋白胰酶消化物15g

          大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g

          氯化钠5g

          琼脂15g

          纯化水1 000ml

          取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿（f90mm1））中。加盖后在室温放至凝固。

B .2       沙氏琼脂培养基（SDA）培养基的灭菌及准备

          葡萄糖 40g

          酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混10g

           琼脂15g

           纯化水1 000ml

取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后为5.6±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿（f90mm1））中。加盖后在室温放至凝固。

B .3        培养基平皿培养及保存

           制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜方法在平皿商做好培养基的名称、制备日期记录的标记。

1） 如采用其他规格的平皿，可适当增减培养基的量，是之在平皿中形成至少2mm厚的琼脂层。

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一剑穿云

QC洁净室微生物静态监测是否需要定期检测，还是首次使用前做三次静态和动态测试。

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