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1 概述消毒剂是对洁净区厂房、设施、设备及产品接触区域进行清洁杀菌和抑菌的化学产品，能消除以细胞繁殖形态出现微生物污染的化学物质。理想的消毒剂应抗菌谱广，低毒或无毒，无腐蚀性，无污染，稳定性好，作用迅速持久，价格低廉。
我厂于2014年顺利完成75%乙醇溶液、0.2%苯扎溴铵溶液、5%甲酚皂溶液的消毒效果及贮存时限的确认工作，截止至2017年，已经过3年的连续使用，均未出现涉及消毒剂的偏差变更等异常情况，现阶段为评价已验证过的消毒剂消毒效果及贮存时是否依然有效，性能是否限发生偏移，现拟对我厂现使用的三种消毒剂进行再次验证。
2 一般事项2.1 验证目的2.1.1 通过对75%乙醇溶液、0.2%苯扎溴铵溶液、5%甲酚皂溶液与特定微生物作用一定时间后，对微生物进行培养、计数，确认消毒剂消毒效果的有效性和可靠性。
2.1.2 通过对消毒剂在一定贮存时间内进行取样检测，确认消毒剂在规定的贮存时限内是否稳定、有效。
2.2 依据标准《药品生产质量管理规范》（2010年版）
《中华人民共和国药典》四部（2015版）
《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》GB/T15981-1995
《消毒技术规范》（2008年版）
2.3 验证类型 本次验证为化学消毒剂消毒效果及贮存时限的再次验证，即再验证。
2.4 验证条件2.4.1 验证实施前，洁净区环境应符合要求，使洁净区环境在良好的受控条件下运行。
2.4.2 涉及到的文件、记录均起草完成。
2.4.3 各室洁净区环境应符合要求。
2.4.4 参与验证的所有人员均已培训并考核合格。
2.5 执行原则2.5.1 执行验证时，必须按本方案的要求执行。
2.5.2 必须修改本方案所列的方法，应经验证委员会批准，并说明修改的理由。
2.5.3 执行过程中如出现偏差，要及时进行记录，并按《偏差处理管理规程》（SMP-QA-0023）进行处理。
3 验证进度 验证小组提出完整的进度计划，经验证委员会批准后实施。
消毒效果确认：2017年01月14日 至2017年01月15日
贮存时限验证：第一次：2017年01月10日
贮存时限验证：第二次：2017年01月11日
贮存时限验证：第三次：2017年01月12日
4 验证内容4.1 人员培训的确认验证实施前，检查参与本验证的相关人员是否经过验证方案及相关标准操作规程的培训并考核合格，将确认结果记录在《人员培训检查确认记录》（附件1）中。
合格标准：参与本验证的人员已经过验证方案及相关标准操作规程的培训，并考核合格。
4.2 验证用文件的确认验证实施前，确认设备及系统具有完整的技术资料，并经整理分类后存入设备档案，系统验证所需使用的规范、标准及操作规程齐全，将确认结果记录在《验证用文件检查确认记录》（附件2）中。
合格标准：所有验证所需使用的规范、标准及操作规程齐全，满足验证需要和GMP的要求。
表1 验证所需文件资料 文件名称 | 编 号 | 验证管理规程 | SMP-VM-0001-01 | 验证方案管理规程 | SMP-VM-0005-01 | 验证报告管理规程 | SMP-VM-0006-01 | 清洁验证管理规程 | SMP-VM-0007-01 | 偏差处理管理程序 | SMP-QA-0022-01 | 变更控制管理规程 | SMP-QA-0023-01 | 检定菌管理规程 | SMP-QC-0015-02 | 培养基管理规程 | SMP-QC-0014-02 | 清洁剂、消毒剂配置和使用管理规程 | SMP-PC-0019-00 | QC室洁净区人员进出标准操作规程 | SOP-QC-0063-00 | QC室洁净区实验用品进出标准操作规程 | SOP-QC-0064-00 | QC室洁净区清洁标准操作规程 | SOP-QC-0065-00 | QC室洁净区工作服清洁灭菌标准操作规程 | SOP-QC-0066-00 | 微生物限度检查法标准操作规程 | SOP-QC-0033-01 | 表面微生物（擦拭法）样品检验标准操作规程 | SOP-QC-0060-00 |
4.3 消毒剂消毒效果的确认4.3.1 验证环境的确认（1） 确认洁净室空调系统已经通过验证，洁净区符合要求，并将结果记录在《洁净室验证环境确认记录》（附件3）中。
（2） 验证实施前，确认验证用洁净服已清洁并在有效期内，并将结果记录在《验证用洁净服确认记录》（附件4）中。
表2 洁净服检查标准
序号 | 环境名称 | 合格标准 | 1 | C级洁净服 | 洁净服已清洁灭菌，并在有效期内 | 2 | D级洁净服 | 洁净服已清洁，并在有效期内 |
4.3.2 验证用试验用具、试验用试液及检验仪器的确认确认验证用试验用具、试验用试液及检验仪器，并将结果记录在《试验用具、试验用试液及检验仪器确认记录》（附件5）中。
表3 试验用具、试验用试液及检验仪器名称及合格标准 序号 | 试验用具、试验用试液及检验仪器名称 | 合格标准 | 1 | CJ-1D洁净工作台 | 验证合格 | 2 | SPX-150BSH-Ⅱ型生化培养箱 | 有检定证书并在有效期内 | 3 | LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器 | 有检定证书并在有效期内 | 4 | 玻璃注射器及硅胶管 | 已灭菌并在有效期内 | 5 | 试管 | 已灭菌并在有效期内 | 6 | 胶塞 | 已灭菌并在有效期内 | 7 | 培养皿 | 已灭菌并在有效期内 | 8 | 无菌棉签 | 已灭菌并在有效期内 | 9 | 磷酸盐缓冲溶液（pH7.2～7.4） | 已灭菌并在有效期内 | 10 | 1%吐温80溶液磷酸盐缓冲溶液 | 已灭菌并在有效期内 | 11 | 0.9%无菌氯化钠溶液 | 已灭菌并在有效期内 |
4.3.3 验证用培养基及菌种的确认确认验证用培养基及菌种是否符合要求，并将结果记录在《培养基、菌种的确认记录》（附件6）。
表4 培养基、菌种名称及合格标准 类别 | 名称 | 合格标准 | 验证用培养基 | 胰酪大豆胨液体培养基 | 培养基适用性检查应符合规定，无菌性检查应合格 | 胰酪大豆胨琼脂培养基 | 沙氏葡萄糖液体培养基 | 沙氏葡萄糖琼脂培养基 | 验证用菌种 | 大肠埃希菌[CMCC（B）44102] | 所有菌种应来源于中国生物制品检定所，工作用菌种的代数应为3～5代 | 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)65301] | 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003] | 白色念珠菌[CMCC(B)98001] |
4.3.4 验证程序5.1 中和剂的选择5.1.1试验器材
分别制备金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]白色念珠菌（ATCC98001）、枯草芽孢杆菌（ATCC 63501）菌量应在1×103 cfu/ml～5×103 cfu/ml,冷藏备用。
消毒剂 | 中和剂 | 稀释液 | 75%乙醇 | 稀释液 | 0.9%无菌氯化钠溶液
| 5%甲酚皂 | 稀释液 | 0.2%苯扎溴铵溶液 | 0.1%吐温80的PBS溶液 |
5.1.2.试验步骤
分6组试验：
第1组 消毒剂 + 菌悬液 →培养
观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
第2组 （消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养
观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
第3组 中和剂 + 菌悬液 → 培养
观察中和剂是否抑菌。
第4组 （消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养
观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
第5组 稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养
作为阴性对照。
根据试验分组，准备足量的试管和平皿，依次进行编号。
（1）第 1 组。吸取1.0ml试验菌悬液于试管内，再吸加4.0ml消毒剂混匀。作用10min，吸此样液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
（2）第2组。吸取1.0ml试验菌悬液于试管内，再吸加4.0ml消毒剂混匀。作用10min，吸此样液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和剂溶液管中，混匀，作用10min。吸取该最终样液1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
如平板生长菌落数均超过 300 个，应以稀释液对上述最终样液作适宜稀释后，再次进行活菌培养计数。
（3）第 3 组。吸取0.1ml试验菌悬液于试管内，加入0.4ml经灭菌的纯化水，混匀。加入4.5ml中和剂，作用10min。各吸取 1.0ml，分别接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
（4）第 4 组。吸取0.1ml试验菌悬液于试管内，吸加4.9ml中和产物溶液（以0.4ml消毒剂加4.5ml中和剂，作用 10min 配制而成）于试管内，混匀。作用10min，各吸取 1.0ml，分别接种于两个平皿中，做活菌培养计数。
（5）第 5 组。分别吸取稀释液、中和剂和无菌纯化水各1.0ml于同一无菌平皿内，倒入上述试验同批次的培养基25ml，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
5.1.3.试验评价
试验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格:
（1） 第 1 组无试验菌，或仅有极少数试验菌菌落生长且远小于第2组。
（2）第 3、4（组）有相似量试验菌生长。其组间菌落数误差率应不超过 15%。第3、4 组间菌落数误差率计算公式其计算公式如下。
file:///C:/Users/QC/AppData/Local/Temp/ksohtml/wps148.tmp.jpg
（3）第5组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应更换无污染的试剂重新进行试验。
（4）连续 3 次试验取得合格评价。
5.1.4.相关记录
中和剂选择试验结果记录
5.2 消毒剂消毒现场模拟试验
5.2.1 菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至TSB培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成相应浓度1.25×105 CFU/样本～1.25×106 CFU /样本（相当于5×103 CFU /cm2～5×104 CFU /cm2）的菌悬液，备用。菌悬液制备后应在2小时内使用，保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。
5.2.2 稀释液：0.9%无菌氯化钠溶液
5.2.3 中和剂： 1%聚三梨酯80溶液、营养培养基
5.2.4 试验步骤
消毒对象按材质分选，彩钢板（墙面），玻璃（窗户），不锈钢（设备），PVC板（地面）分别进行消毒效果测试。每次测试样品为各类物表面3个不同的5.0cm×5.0cm样本。
分别用无菌棉签沾以菌悬液均匀涂抹被试表面的6个区块(各为25cm2)。待自然干燥后进行试验。3个区块作为阳性对照区，3个区块为试验区。
阳性对照组：将无菌棉签于含5ml稀释液试管中沾湿，对3个对照组区块涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉签采样端剪入原稀释液试管内，手工振荡200次，作用10min。
试验组：将消毒剂涂擦于物体表面进行消毒，作用时间细菌、真菌为15min；芽孢为30min。消毒后，将无菌棉签于含5ml中和剂试管中沾湿，分别对3个消毒区块进行涂抹采样，每区块横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉拭采样端剪入原中和剂试管内，振荡200次，作用10min。
试验结束后，将用过的同批次中和剂（稀释液）各1.0ml接种培养基，作为阴性对照组样本。
将阳性对照组、阴性对照组和消毒组样本，每份吸取1.0ml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37℃恒温箱中培养48h（细菌）或72h（真菌或芽孢），观察最终结果，计算杀灭对数值。
0.2%新洁尔灭溶液、75%乙醇、5%甲酚皂溶液试验各重复3次。
5.2.5 可接受标准
阳性对照组菌数符合要求，阴性对组无菌生长，所有样本的杀灭对数值均≥3.00。
将消毒剂现场模拟试验结果记录在《消毒剂现场模拟试验结果记录》（附件8）。
6 消毒剂贮存时限验证6.1 验证环境确认 验证实施前，检查确认车间洁净区洁净度相关监测数据的监测报告，是否符合GMP对洁净区环境的要求，并在良好的受控条件下运行，将结果记录在《车间验证环境确认记录》（附件9）中。
合格标准：验证所需环境符合相应级别的洁净度标准，并在有效期内。
6.2 限度标准检 查 项 目 | 可接受限度标准 | 可见异物 | 无可见异物 | 75%乙醇溶液性状 | 无色澄明液体 | 0.2%苯扎溴铵溶液性状 | 无色澄明液体 | 5%甲酚皂溶液性状 | 无色澄明液体 | 消毒剂微生物限度 | 应无菌生长 |
6.3 取样工具（1） 取样工具的处理
具塞三角瓶、试管、无菌注射器、硅胶管：121℃30min湿热灭菌。
（2） 取样工具的确认
验证实施前，确认取样工具是否按要求处理，是否在有效期内，将确认结果记录在《取样工具检查确认记录》（附件10）中。
合格标准：验证使用的取样工具已按要求经过处理，并在有效期内。
6.4 消毒剂配制容器具的确认验证实施前，检查确认消毒剂配制所用的器具是否按《D级洁净区容器具清洁规程》(SOP-PC-0009)清洗，将检查结果记录在《消毒剂配制容器具确认记录》（附件11）中。
合格标准：验证所需的器具已清洗，并在有效期内。
6.5 消毒剂的配制和存放（1） 按照《清洁剂、消毒剂配制、发放标准操作规程》（SOP-PC-0019）配制消毒剂。
（2） D级洁净区使用的75%乙醇溶液、0.2%苯扎溴铵溶液、5%甲酚皂溶液，用不锈钢桶密闭存放于洁具室，QA检查员分别在0小时、24小时、48小时、72小时进行取样，检查消毒剂是否有可见异物、性状、微生物限度。
6.6 取样和检验方法QA检查员分别在四个取样点，使用无菌注射器配合硅胶管分别取75%乙醇溶液、0.2%苯扎溴铵溶液、5%甲酚皂100ml，依次放置于经灭菌的洁净250ml具塞三角瓶中，目视检查消毒剂中是否存在可见异物、及形状是否发生变化；如未发生变化则送QC检验室按《微生物限度检查法标准操作规程》（SOP-QC-0033）检查消毒剂中的微生物限度。检查结束后QA检查员汇总检测结果，并记录在《D级消毒剂贮存时限试验结果记录》（附件12）中。
7 验证结果与结论7.1 按照验证方案的内容认真核对和审查7.1.1 检查主要的验证试验是否按计划完成；
7.1.2 检查验证方案在实施过程中有无修改；修改的理由是否明确并有批准手续；
7.1.3 重要试验结果的记录是否完整；
7.1.4 验证结果是否符合设定的标准；对偏差的结果有否做过调整，是否有适当的解释并获批准。
7.2 验证结论由验证实施小组对验证结果进行评价，评定化学消毒剂消毒效果及贮存时限的实际适应性，并报验证委员会批准。
8 再验证周期验证合格后，由验证实施小组根据验证结果和风险评估结果确定再验证周期，并将结果列入验证报告中，报验证委员会批准。
9 附件附件1 人员培训检查确认记录
附件2 验证用文件检查确认记录
附件3 验证环境确认记录
附件4 验证用洁净服确认记录
附件5 试验用具、试验用试液及检验仪器确认记录
附件6 培养基、菌种的确认记录
附件7 中和剂鉴定试验结果记录
附件8 消毒剂现场模拟试验结果记录
附件9 车间验证环境确认记录
附件10 取样工具检查确认记录
附件11 消毒剂过滤系统安装确认记录
附件12 D级消毒剂贮存时限试验结果记录
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发表于 2017-5-6 13:58:18
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