分享环境监测微生物采样回收率的思考，欢迎指正

lostfish

和大家分享一些我对于环境监测微生物采样回收率的思考，供大家讨论和指正。

针对环境监测中，微生物的采样方法回收率，大家都知道要做。这在药品GMP指南——质量控制实验室与物料管理和欧盟GMP附录1等法规中也有相应的要求，下面截取最新欧盟GMP附录1的描述：

欧盟GMP附录1无菌药品生产（2022）：“9.29 Sampling methods and equipment used should befully understood and procedures should be in place for the correct operationand interpretation of results obtained. Supporting data for the recoveryefficiency of the sampling methods chosen should be available”（应充分了解采样方法和所使用的设备，并应制定规程以便正确操作和解读所得结果。应当有所选采样方法的回收效率的支持性数据）。

而具体方法，无外乎沉降菌是通过考察平皿在一定温湿度、风速、暴露时长等日常可能的最极端条件下，其干燥度和微生物生长情况，以确认微生物回收率；浮游菌是考察在一个独立密闭腔室中，定量微生物气雾被仪器所采集的情况，以确认其回收率，详见药品GMP指南——质量控制实验室与物料管理18.4.5。考虑到操作难度，很多公司会找仪器供应商提供相关资料。但供应商实验所用菌种是否合适，所用培养基是否和我们自己用的相一致，进而其资料是否充分且适用，这一点则是我有疑惑的地方。不知道大家是怎么考虑和实施的。

最后的关键问题则是表面微生物，不知道其他公司怎么样，反正我们尝试过按照药品GMP指南——质量控制实验室与物料管理18.4.5中提到的方法进行测试（即将试验菌涂布于平面上再用相应采样方法采样后计算回收率），但实际效果很难达到50%以上的回收率。这一点在PDA TR29的清洁验证6.5.5中能找到相应支撑。“Recovery studies to determine percentage recoveryfrom surfaces are not appropriate and are not normallydone for microbiologicalsampling. One reason for this is the question of enumeration in microbiologicaltests– “colony forming units” are typically counted as opposed to individualorganisms.A second reason for this is that vegetative organisms will die orlose viability when dried on a couponin a standard sampling recovery procedure.A third reason is that it is unclear which species should beused for a recoverystudy. A fourth reason is that typically the limits set for bioburden aresignificantlybelow what could possibly cause either product quality issuesorprocess performance (e.g., SIP) issues;therefore, even though recovery may below (<50%), product quality and/or process performanceis not impacted by notincluding a recovery factor”（对于微生物取样，不适合进行回收率研究以确定表面百分回收率。原因之一是微生物检测的计数问题&#8722;通常以“菌落形成单位”进行计数而不是单个微生物。第二个原因是在一个标准的取样回收率研究中，当材质试样晾干时微生物会死亡或失去生存能力。第三个原因是不清楚选用哪种微生物进行回收率研究。第四个原因是通常生物负载限度已明显低于可能影响产品质量或工艺性能（如在线灭菌）的水平。因此，即使回收率低（<50%），不引入回收因子也不会影响产品质量和/或工艺性能。）

那么此路不通，只能从另外的角度思考。结合老版欧盟GMP附录1的9.3中描述“Where microbial testing of surfaces in clean roomsis carried out, validation should be performed on the test method to confirmthat sanitising agents do not influence the recovery of microorganisms.”（当实施对洁净室进行表面微生物检测时，测试方法应经过验证，以确保消毒剂不影响微生物回收率）。那么考虑重点来到了消毒剂在培养基、拭子管中的残留对表面微生物采样回收率的影响。虽然我们开始使用TSAWLP等含有卵磷脂、吐温80等能够消除消毒剂影响的培养基。但是因为消毒剂种类的多样性以及消毒剂残留量的差异。上述的培养基所含有的中和剂的类别是否针对性的满足我们日常所使用的消毒剂，以及结合消毒剂残留验证中的残留量是否在中和剂能够降解的范围内。这些才是我们需要验证或者提供资料证明的。具体操作我设想的是，收集所用消毒剂的信息以及消毒剂残留验证中的结果，将其与含有中和剂的培养基的资料进行对比，或让培养基供应商协助进行评价。

不知道这样的思路是否正确，欢迎大家指正。

wenzhao10

没有这么复杂吧，我们培养基到了会做适用性检查和无菌检查，再做一个再生物安全柜内摆放3.5h、4h的平皿做个回收试验，其他的根据生产情况选用不同种类的培养基

915_雨

个人理解哈：
低就低了，做完就知道后续检出时，实际情况可能很坏。目的可能就是这个。
另外，环境微生物类的回收率研究，关注的是培养基在采样完后，依然保持着符合要求的适用性就够了。

lostfish

wenzhao10 发表于 2022-8-30 16:01
没有这么复杂吧，我们培养基到了会做适用性检查和无菌检查，再做一个再生物安全柜内摆放3.5h、4h的平皿做个 ...

你前半部分说的是培养基本身的。而采样回收率是证明你所用的物品和方法，能够最大程度接近真实的收集并呈现出你环境中实际的微生物数量，不至于出现监测结果看似很好，实际环境已很糟糕的情况。你后半部分说的就是这个目的，不过只是沉降菌的（即避免沉降菌摆放过长导致上面的微生物死亡甚至假阴性）。

lostfish

915_雨 发表于 2022-8-30 16:25
个人理解哈：
低就低了，做完就知道后续检出时，实际情况可能很坏。目的可能就是这个。
另外，环境微生物 ...

嗯嗯，不过低可能只是回收率验证方法本身的问题，即涂布和污染过程本身就使得微生物大量减少。并不能说明擦拭方法本身回收率不好。所以我觉得是表面回收率暂时没有很好的方法去证明，除了消毒剂的影响。
另外，采样的回收率，我想的是通过验证或数据，证明采样方法不会对结果造成严重的不良影响，甚至假阴性的情况。

小金库

谢谢楼主大公无私分享！