小奕说药 | 早期开发阶段的抗体N-糖快速表征分析策略

奕安济世生物药

导语

糖基化修饰对抗体药物的稳定性、半衰期、安全性及生物活性具有重要影响。不同的工艺所形成的分子糖型不同，在早期工艺开发阶段，快速及时地获取分子的N-糖糖谱信息对于加快细胞株和上游工艺开发具有重要意义。

1.N-糖糖谱表征的三大策略当前对于N-糖糖谱主要有三大类分析策略，即分别在游离糖水平、糖肽水平以及分子量水平进行分析（图1）。游离糖水平进行N-糖糖谱分析涉及N-糖的酶切、衍生试剂标记和液相或质谱分析这几个步骤，经典的游离糖水平的N-糖分析方法是2AB-UPLC法或2AA-UPLC法。除了在游离糖水平进行N-糖分析外，依靠质谱技术在糖肽或分子量水平进行分析也是实现快速分析的一种可行手段。就单抗而言，由于通常单抗在重链的CH2区上只有1个N-糖基化位点，在完整蛋白水平或亚基水平进行分子量分析可以获得蛋白的N-糖基化类型和糖型丰度的信息。其中，糖基化类型可以通过离子簇的质荷比解析，糖型丰度信息则与对应的离子簇的信号强度成正比，所以带有糖基化位点的亚基越小、获得的质谱图复杂程度越低，则越能够解析出丰度较小的糖型，所获得的糖型分析结果也就越接近真实值。 图1 抗体N-糖表征分析策略示意图2.游离糖水平的N-糖快速分析策略经典的N-糖糖谱表征是通过N-糖苷酶切下糖链后，使用衍生试剂2-AA或2-AB进行标记，再通过高效液相色谱法进行分析。对于传统的2-AA或2-AB标记法， N-糖的酶切和衍生试剂标记是主要限速步骤。为此，各大厂商相继开发了快速N-糖分析试剂盒，提供了快速N-糖苷酶切和衍生试剂快速标记商业化方案。在游离糖水平进行N-糖快速分析，主要还是借助这些商业化试剂盒来实现。
3.亚基分子量水平的N-糖快速分析策略为了获取含有糖基化位点的亚基片段，通常可以采用对完整抗体进行还原的方法，将重链（HC）和轻链（LC）分开，通过对重链（HC）质谱图进行解析，即可在HC水平解析得N-糖糖谱信息；如果使用工具酶IdeS将HC进一步酶切,可以获得更小的含糖基化位点的亚基片段（scFc）, 对scFc片段的质谱图进行解析，即可获得更精确的N-糖糖谱信息。
大分子早期工艺开发阶段对N-糖糖型的检测需求主要来自于细胞株开发和上游培养工艺，特别是细胞株开发，所提供的检测样品量很少，样品再经过Protein A过柱纯化后亦会产生损失。为了满足这部分检测需求，奕安济世建立了一种略过Protein A纯化步骤，直接对细胞培养物进行IdeS酶切和质谱上样的N-糖分析方法（称为Zipchip CE-MS Subunit Mass 法）。该方法使用Zipchip CE-MS系统，实现在纳升水平进行质谱上样分析。样品上样前用特定稀释液进行高比例稀释，再加上在纳升水平上样，样品中各种HCP、培养基成分和盐等对质谱产生的干扰可以被显著降低。由于该方法对样品前处理比较简单，容易实现前处理的批量操作，再加上Zipchip CE-MS系统可以对样品进行快速分离和检测（数分钟内即可完成1个样品的检测），故该方法可以实现对样品N-糖糖型高通量检测。为了确认该方法的准确度，将Zipchip CE-MS的检测结果同2AB-UPLC法进行比对，确认了 Zipchip CE-MS方法和2AB-HPLC法的结果具有较高的一致性（图2）。目前，我们已经将该方法应用于细胞株筛选，助力于细胞株开发工艺的进一步提速。当然，由于灵敏度受限，部分低丰度糖型可能无法测得（如图2中的Man5等），在后续工作中，会进一步开展方法学优化。
图2 Zipchip CE-MS Subunit Mass 法应用于某单抗单克隆筛选

4.糖肽水平的N-糖快速分析策略在糖肽水平进行N-糖检测，在业界各大公司已经有了很成熟的方案。奕安济世也开发了自己的糖肽分析方案（简称Glycopeptide Mapping 法），该方案可在1.5h内快速完成蛋白的变性、还原、烷基化以及高温酶切，同时使用一套快速的LC-MS检测方法，并应用质谱工作站自动完成糖肽检索分析。虽然相较于Zipchip CE-MS Subunit Mass 法，样品制备和仪器分析需要多耗费大约2h/样的时长，而且要求将细胞培养物经protein A色谱柱过柱纯化得到抗体才能进行分析，但该方法可以避免出现N-糖脱GN的情况，而且能精细地将低丰度糖型进行表征分析，并提供足以媲美经典2AB法的N-糖分析准确结果（图3）。该方法已经成功应用于单抗分子Top Clone糖型的最终确认和上游细胞培养工艺样品的糖型分析。
前述的Zipchip CE-MS Subunit Mass 法适用于细胞株快速筛选，事实上这种快速方法一定程度上牺牲了检测灵敏度,特别是对于低于1%的N-糖，容易出现无法解析出来的情况。如果需要达到经典的2AB法的检测灵敏度，需要在糖肽水平展开分析， Glycopeptide Mapping 法也就成了非常好的候选方法。另外，对于拥有多个N-糖基化位点的双抗或融合蛋白而言，由于糖型修饰非常复杂造成质谱图难以解析，在这种情况下，使用Glycopeptide Mapping 法可以精准获取各个糖基化位点的糖谱信息，同时还能解析出可能存在的O-糖糖谱信息。
图3 Glycopeptide Mapping 法与常规2AB-HPLC法应用于某单抗多个克隆的N-糖糖谱分析结果比对
5.Zipchip Subunit Mass法与Glycopeptide Mapping法的优缺点比较 总的来看，游离糖水平的2AB-UPLC法是通用型方法，适用范围广，是N-糖糖谱分析的“金标准”方法；Zipchip CE-MS Subunit Mass法样品消耗少，前处理简单，适用于细胞培养物分析，极大满足了细胞株开发阶段样品的快速检测需求，对仪器配置有特定要求故限制了其推广；Glycopeptide Mapping法能对低丰度糖型进行准确分析，检测结果与经典的2AB-UPLC法高度一致，同时还能解析不同糖基化位点的N/O-糖修饰信息，具有很大的应用潜力，对于配备了LC-MS的药企来说是一个很好的选择。奕安济世拥有在以上三个不同水平的N-糖快速表征方案，可以根据客户项目需求“私人订制”最适宜的N-糖分析方法，为客户项目提供高质量和高性价比的CDMO服务。

猫咪特工

谢谢分享

xqliu

学习了，谢谢提供分享。