线上2024.06.25 | 理论与操作：细菌内毒素检测深度分享

IPPM小助手

内毒素检测在生物医药领域中至关重要，注射类药物、注射器具，植入医疗器械等都有相应的质量标准，用以确保产品安全性。然而，在进行内毒素检测的过程中，许多实验室和研究人员可能会面临一系列挑战和疑惑。

本文带来内毒素检测的“十问十答”，想深度了解内毒素检测的理论与实践，由业内知名的内毒素检测专家王晓明老师、Lonza技术专家王红老师带来“理论与操作：细菌内毒素检测深度分享”，请扫文末课程海报进行报名。

扫码报名，免费听课

1. 什么是细菌内毒素？

内毒素（Endotoxin）是一种脂多糖（LPS），来源于革兰氏阴性细菌外膜，其细胞壁外膜的外部脂质成分由内毒素分子组成，细胞死亡或分解后被释放出来。内毒素单位为EU。

1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来内毒素，进行化学免疫学方面的研究。直到二十世纪60年代，美国学者Levih和Bang发现细菌内毒素检查法（又称鲎试验法），并将之正式建立为“一种定性或定量检测微量细菌内毒素的分析方法”。美国药典于80年代首先收载此法，其后英、德、意、日等国相继收载了这一检查方法。

内毒素污染是生物技术和药物应用中的一个常见问题，内毒素的存在已被证明会导致细胞毒性、热原免疫反应并降低转染效率。因此，对内毒素进行准确的定量尤为重要。

2. 内毒素的检测方法有哪些？

1、热原检查：通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。

2、凝胶法：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。

3、光度法：包括浊度法和显色法，可定量检测内毒素的含量。

1）浊度法：利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。

2）显色法：利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。

▲热原检查、凝胶法与光度法的对比（来源：微谱医药技术服务）

3. 如何选择内毒素检测试剂盒？

检测测方法的选择：

如果做范围定性检测，可以使用凝胶法试剂盒（如PYROGENT）。但如果需要定量检测，凝胶法试剂盒可能就不适合，因为凝胶法检测一般只能给出小于或大于的结果，其通过对样品进行多次稀释，将样品的EU/ml结果缩小到一个范围，一般是当作半定量的方法。

如需要选择定量检测进行内毒素检测比较适合的是浊度法试剂盒（如PYROGENT-5000），显色法试剂盒（如Kinetic-QCL）和重组C因子方法试剂盒（如PyroGene）。

▲ PYROGENT-5000动态浊度LAL试剂盒

▲ Kinetic-QCL 动态显色法LAL试剂盒

另外，在样品放行限度和样品稀释需求进行检测灵敏度考量方面：

· PYROGENT凝胶法试剂盒灵敏度为0.03、0.06、0.125 和 0.25 EU/mL

· 动态浊度法PYROGENT-5000试剂盒灵敏度为0.01EU/mL

· 动态显色法Kinetic-QCL灵敏度为0.005EU/mL

· 重组C因子方法检测灵敏度为0.005EU/mL。

4. 内毒素检测需要哪些仪器设备？

不同内毒素检测方法需要使用不同配置的设备。

使用PYROGENT凝胶法，则需要37°C 恒温加热仪。

使用动态显色法Kinetic-QCL或动态浊度法试剂盒PYROGENT-5000，则需要光吸收酶标仪和相应软件。酶标仪还应具有振荡和37°C恒温孵育功能，动态显色法Kinetic-QCL需要配置405nm光吸收检测通道，PYROGENT-5000试剂盒需要340nm光吸收检测通道。Lonza Elx808、Nebula MMR、Nebula AR均能满足以上性能要求。

▲ Nebula吸光度酶标仪

使用PyroGene重组C因子试剂盒，则需要380nm（激发波长）/440 nm（发射波长）滤光片组合荧光酶标仪，Lonza PyroWave XM、Nebula MMR均能满足以上性能要求。

▲ PyroGene 重组因子C试剂盒

所有的内毒素检测试剂盒的使用都需要使用涡旋混匀仪和移液器，以及计时器。

此外，推荐搭配内毒素检测专用软件WinKQCL，用于内毒素定量检测。该软件除了具有常规的数据采集、权限管理、审计追踪、数据完整性、数字签名、数据分析、报告生成和导出、LIMS/MES等系统对接功能和数据备份功能外，还有您所期望的趋势分析、数据安全性和“smart stop”（智能停止）功能，以及审计追踪条目筛选、一个板子同时运行多个实验并独立生成报告的功能。

5. 为什么建议使用玻璃器皿不建议使用塑料器皿？

塑料表面比玻璃表面对内毒素的吸附力更强。因此，建议制备内毒素对照标准(CSE)稀释液时使用硼硅酸盐玻璃稀释管。某些情况下，某些塑料器皿也可以用于内毒素检测。

总之，玻璃是首选材料，PE（聚乙烯）次之，PP（聚丙烯）再次之，也有客户反馈还可以使用PET材质器皿。如果需要对样品进行保存，建议对不同材质容器的进行相应验证，保证样品中内毒素在储存后是否可以回收的。

6. 为什么CSE稀释液配置涡旋过程很重要？

内毒素会粘附在玻璃表面上，可以通过适当的涡旋来充分溶解和混匀，以保证反应管或微孔板中的溶液具有准确的EU/ml浓度。如说明书所述，稀释之前，CSE小瓶应剧烈涡旋15分钟，每次使用CSE时都应重复此操作。标准品梯度稀释液配制时，建议至少涡旋一分钟。标准品使用前也建议涡旋CSE稀释液几秒钟以确保均匀度和准确性。

7. 为什么要使用匹配的试剂？

首先，是合规性要求。

其次， Lonza的每个LAL鲎试剂批次都使用美国药典内毒素参考标准品(RSE)EC-6（效价为10000EU/瓶）进行效价测试。然后通过与RSE平行测试，将该LAL鲎试剂批次与我们的工作标准品(CSE)相匹配。该RSE/CSE相关测定确定了该批次CSE与该批次LAL鲎试剂一起使用时的效力，因此需要匹配使用。

FDA表示，使用LAL鲎试剂制造商的质量证书使公司不必自己进行RSE/CSE比较。Lonza提供所有检测方法的试剂盒，并且有匹配的试剂，使内毒素检测更简单。

8. 如何确定工作标准品(CSE)的效价？

Lonza用于测定CSE效价的方法可在每个匹配试剂盒的CoA中找到。

常见方法为：多支CSE稀释后被当作未知样品，通过RSE稀释梯度来进行检测和计算，单位为EU/ml。对于定量检测方法，检测结果在RSE标曲范围内的多支CSE检测值进行平均即可得到效价。

9. 应该如何配制LAL试剂？

请温柔对待Lonza LAL鲎试剂。复溶后通过轻轻倒置或旋转小瓶，瓶内试剂会很容易溶解，涡旋或剧烈摇晃复溶后的LAL试剂会产生气泡。

使用前几分钟重新配制即可，加入LAL鲎试剂后，切勿涡旋。

10. 应该如何准备样品进行测试？

测试前，需要根据样品实际情况进行样本前处理。大多数样品只需要稀释，使用内毒素检测试剂盒进行测试即可。

可以通过样品的MVD（最大有效稀释倍数）确定样品的可稀释倍数。样品MVD=内毒素限值(EU/ml)/λ（λ为标准曲线的最低浓度值，对于凝胶凝块，λ为鲎试剂的标记灵敏度）。样品稀释倍数不能超过MVD，为了保证足够的安全范围，建议稀释倍数尽量不要超过1/2MVD。

如果样品有蛋白酶干扰并导致假阳性结果，建议对样品稀释并70°C加热5-15分钟进行热灭活处理。如需要，可以对灭活样品进行进一步稀释后检测。

如果样品可能含有受β-葡聚糖，建议使用β-葡聚糖阻断剂(b-G-BlockerTM)。β-葡聚糖可能来自酵母和纤维素材料。鲎试剂测试中可以看到β-葡聚糖常见的稀释/反应模式：浓缩样品的阴性响应、稀释度增加时阳性响应，最高稀释度时阴性响应。使用动态检测法，β-葡聚糖污染的样品中经常出现协同增强效应。

如果样品中因含有内毒素结合物而存在抑制，可以尝试使用分散剂PYROSPERSE。比如脂质乳化剂，电解质溶液，血清和血浆蛋白样品也可以使用PYROSPERSE。

如果您想深入了解内毒素检测的理论知识，还是渴望掌握更多实际操作技巧，6月25日晚特邀业内知名的内毒素检测专家王晓明老师、Lonza技术专家王红老师，与大家直播分享关于细菌内毒素检测的内容。不想错过，就请立刻扫码报名吧！

二、课程信息

三、报名方式

1、手机端
扫描上图二维码，进入报名页面
2、PC端

复制以下网址，电脑端打开报名

https://mscapp.jingsocial.com/mF/ems/none/NxpCdBZNGREvUjLjdRNE9j/xHBVeRTrRTro8RnHozHxoB1

四、课程获得

1、了解与掌握细胞内毒素检测方法，建立内毒素质控方法

2、课程奖品限量抽取

3、扫码添加课程小助手（备注：0625），将获得：课程最新信息；加入蒲公英交流群，更多干货与行业资讯

特别鸣谢

龙沙是全球制药、生物技术与营养市场的优秀合作伙伴。我们致力于助力客户推出创新药物辅助治疗一系列的疾病，成就更健康的世界。为达成这一使命，我们将先进生产制造、科学专业技术、卓越工艺及技术洞察力完美结合。为满足客户复杂的需求，我们的业务按四大板块划分为生物技术、小分子、细胞与基因、胶囊与健康原料。我们全方位的产品与服务帮助客户在医疗保健行业的发现与创新成果实现商业化。
1897年，龙沙诞生于瑞士的阿尔卑斯山脉地区。发展至今，业务已遍及全球五大洲。我们拥有约17,500名全职员工，由他们组成的高效团队及每一名员工都为我们的业务和所在地区及国家做出意义非凡的改变。2022年，公司销售额达62亿瑞士法郎，核心业务的息税折旧摊销前利润（EBITDA）达20亿瑞士法郎。
更多详情，请访问 www.lonza.com。

扫码获取产品介绍与应用文章