摇瓶工艺-细胞复苏

名字不重要

一.  生产前准备工作：
1.1细胞出库申请单签批完成；批记录签批完成。

1.2生产前设备确认：除常规检查外（计量验证清洁）。摇床提前开启，确认运行状态良好；水浴锅加水是否用到烧杯，进行工器具泡碱；电动移液器电量等。

1.3物料。培养基配置完成，检测合格。可能需要准备其他添加剂，如MSX。

1.4 耗材领用：摇瓶、移液管、离心管、EP管、（冻存管、储液瓶）、无菌擦拭布、无菌乙醇、无菌手套、无菌套袖。镊子、剪刀、试管架、冻存管架、马克笔、塑封膜等。

1.5程序降温盒是否用得到，提前预冷；培养基是否需要预热。

1.6 跨部门取细胞，协调沟通完成，涉及QA（取细胞，现场QA--沉降菌，浮游菌，悬浮粒子，表面微生物，五指取样），QC（根据平台要求检测），供应链。

二.  操作流程：
2.1 无菌意识/操作
所有进入生物安全柜的物品全部进行酒精灭菌；生物安全柜内也要清洁到位，紫外照射，无菌擦拭；人无菌意识到位（手套袖套喷乙醇），放置培养皿（左中右）。

2.2 培养基预热
在生物安全柜内取培养基10 mL加入15 mL离心管，再取30 mL培养基加入125 mL摇瓶中。将加入培养基的15 mL离心管与125 mL摇瓶置于二氧化碳摇床中37.0℃预热不低于30 min。

注意：喷酒精时，不可浸湿摇瓶盖子上的透气膜。摇瓶取出后就对摇瓶进行编号并写在瓶身上。

2.3 取出冻存管
复苏前根据细胞出入库台账确认种子细胞在液氮罐中的具体位置。从液氮罐中快速取出细胞盒，用镊子夹住冻存管取出所需细胞。核对细胞信息，确认细胞信息与细胞出库申请单一致，并检查冻存管盖子是否旋紧。

取出细胞后，放置再转移容器中（预冷完成的程序降温盒，液氮转移罐。如果可以，转移过程中监测温度），将转移容器中细胞通过传递窗传入C级区域，由C级区域人员完成复融及复苏工作。

注意：转移过程冻存管不可倾斜或倒置倾倒，保持瓶盖向上。传递窗切不可开启紫外照射。预冷前，检查程序降温盒异丙醇是否足够。

2.4 复融解冻与细胞离心
操作人员检查：确认细胞冻存管盖是否旋紧，冻存标签是否完整清晰。确认和记录细胞信息，黏贴冻存标签。

细胞解冻：迅速将冻存管放入37.00℃水浴中并轻摇冻存管使其全部复融解冻，复融解冻时间不超过3 min，过程中监控水浴温度。

注意：冻存管管帽下沿不可浸没至WFI中，移动过程中冻存管不可倾倒。

细胞离心：完成复融解冻后，在生物安全柜中打开冻存管，用无菌移液管将冻存管内所有细胞悬液加入装有10 mL培养基的15 mL离心管中，室温离心，离心机参数设置：800 rpm，离心5 min。

离心完成后，在生物安全柜内用无菌移液管将15 mL离心管中上清液吸出，然后从125 mL摇瓶中取适当体积预热的培养基重悬细胞，并将细胞悬液全部转入125 mL摇瓶中。

注意：加入细胞液时，用移液管缓慢吹打细胞，尽可能控制气泡形成。

2.5 细胞计数与细胞培养
细胞计数：缓慢摇匀细胞，用无菌移液管无菌取出0.6-1.0 mL细胞悬液，用Vi cell细胞计数仪进行计数。

注意：计数命名规则的知悉；细胞计数仪细胞参数类型的建立。

将125 mL摇瓶标记后放入CO2摇床培养箱进行培养。记录CO2摇床参数。

2.6 取样和清场
操作结束时，完成表面微生物取样。可能区分操作台面表面微生物取样和操作人员五指取样。

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走吗

好详细，我做的贴壁细胞就没有这么复杂，水浴锅复苏，就开始离心了。

胜利者

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