Co-IP 实验不踩坑：蛋白 "拉下场" 的秘密！揭秘Co-IP实验操作技巧

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在蛋白生物学的世界里，Co-IP 是解锁蛋白质“朋友圈”的神兵利器。但如果操作不当，它可能会变成实验室里的“尴尬社交”。今天，我们就来聊聊如何让你的 Co-IP 实验优雅又高效，轻松把蛋白“拉下场”！

01什么是 Co-IP？
免疫共沉淀 (Co-Inmunoprecipitation, Co-IP) 是一种利用目标蛋白特异性抗体与蛋白 A/G 磁珠或琼脂糖珠结合，从而沉淀目标蛋白及其相互作用蛋白的技术 [1-4]。

图 1.  Co-IP 原理图。

X：诱饵蛋白，Z：靶标蛋白

简单来说，就是利用抗体捕捉目标蛋白，看看有哪些其他蛋白会“搭顺风车”来到沉淀派对。这样我们就可以知道哪些蛋白质在细胞内是好朋友，经常一起 Hang out！

Co-IP 优势

可沉淀诱饵蛋白在天然组织细胞状态下存在互作关系的所有蛋白；

可沉淀整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；

可与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证；

分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体，结果更真实可靠。

Co-IP 分类

根据抗体来源、靶蛋白表达方式及样本类型等差异，Co-IP 可分为单克隆抗体/多克隆抗体 Co-IP、内源性/外源性 Co-IP、探索型/验证型 Co-IP 等类型。

在众多 Co-IP 分类方式中，内源性和外源性 Co-IP 就像科研界的双子星，不仅最常用，还各自闪耀独特的光芒！

小贴士：

内源性 Co-IP：研究细胞或组织中自然表达的蛋白质。

外源性 Co-IP：研究经过转染介导的外源表达系统来表达的蛋白质。

02 操作步骤与结果分析

Co-IP 实验流程

图 2. Co-IP 实验流程图[1][5]。

Co-IP 流程 (以内源性 Co-IP 为例)[1]

01样本准备

采用适当的方法收集细胞，使用含有合适的蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。

02固相介质准备

将含有保护液的蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖混匀取出，用平衡液清洗磁珠/琼脂糖凝胶。

03预清洗 (可选)

将细胞裂解液或已预处理的样本用蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖进行预清洗，去除非特异性结合的蛋白质。

04免疫沉淀

预清洗的样本中加入诱饵蛋白的特异性抗体，孵育促进抗体与蛋白结合。加入蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖继续孵育使其与复合物结合。

05洗涤

洗涤复合物，去除非特异性结合蛋白。

06洗脱

加入洗脱缓冲液，洗脱。

07分析

Western Blot 或质谱检测分析沉淀的诱饵蛋白及与其结合的靶标蛋白。

小贴士：
内源性 Co-IP 实验可选择[color=var(--weui-LINK)]蛋白 A/G 磁珠或[color=var(--weui-LINK)]蛋白 A/G 琼脂糖；外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等)，可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 [color=var(--weui-LINK)]Anti-Flag 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]Anti-HA 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]Anti-c-Myc 磁珠、[color=var(--weui-LINK)]Anti-GST 磁珠等)，可一定程度增强丰度，减少 IgG 干扰。

Co-IP 结果解读

随着 Co-IP 实验流程的完成，我们终于手握初步数据！那么，这些数据能告诉我们什么秘密？结果出来了，肿么分析呢？以下让小 M 通过两个经典案例，来看看如何解读实验结果，挖掘蛋白质相互作用的“朋友圈”！

内源性 Co-IP 结果解读

图 3. 内源性 ANT2 和 GRP75之间存在相互作用[6]。

外源性 Co-IP 结果解读

图 4. 外源 GRP75 可增强 ANT2-UCP1 的相互作用[6]。

03避坑指南：如何高效无误地进行 Co-IP?

样品准备：打好地基

拉蛋白就是请客吃饭，不给它们舒适的环境，谁都不愿来！

关注点	说明
裂解液	温和的非离子型洗涤剂 (如 NP-40、Triton X-100) 可以保护蛋白的天然结构，同时避免过强的去污剂 (如 SDS) 破坏蛋白相互作用。 MCE 裂解液推荐：[color=var(--weui-LINK)]WB/IP 裂解液、[color=var(--weui-LINK)]NP-40 裂解液、[color=var(--weui-LINK)]哺乳动物活性蛋白抽提试剂。
盐浓度	样品准备时体系中的盐浓度范围在 150 - 300 mM 即可，过高可能“拆散”蛋白关系，过低可能导致背景蛋白“搅局”。
蛋白酶抑制剂	适当加入蛋白酶抑制剂，保护“核心成员”防止其被细胞内源性蛋白酶降解。 MCE 蛋白酶抑制剂推荐：[color=var(--weui-LINK)]蛋白酶抑制剂 Cocktail、[color=var(--weui-LINK)]蛋白酶抑制剂 Cocktail, 片剂。
结构干扰	提前查阅文献了解蛋白“爱好”，重视蛋白修饰，如磷酸化、乙酰化等是否会影响复合物的稳定性。
表达水平	提前验证目标蛋白表达水平，表达低可考虑优化转染或表达条件。
温度	低温环境下制备样品，防止蛋白“跑路”。

抗体选择：定向输出

抗体选不好，后果你懂的……

无论是拉下目标蛋白还是背景干扰，抗体都能“一锤定音”。

关注点	说明
抗体专一性	选择经过 IP 验证的抗体，不可盲选。 MCE 标签抗体：[color=var(--weui-LINK)]DYKDDDDK Tag (FLAG) 抗体、[color=var(--weui-LINK)]HA tag 抗体 (YA856)、[color=var(--weui-LINK)]Myc-tag 抗体。
同型对照	根据 IP 抗体类型选择合适的同型对照抗体。 MCE 同型对照抗体推荐：[color=var(--weui-LINK)]Rabbit IgG Isotype Control、[color=var(--weui-LINK)]Mouse IgG Isotype Control。
抗体来源	一抗和二抗的宿主种属要避开“同宗”，否则背景会抢戏。
抗体测试	必要时进行预实验封闭抗体测试，验证磁珠/琼脂糖珠可与抗体有效结合。
抗体用量	太多可能造成非特异性沉淀，太少又可能拉不住目标蛋白。建议从优化实验中找到合适的浓度和用量。
二抗选择	如果抗体重链和目标蛋白大小相近，可选择轻链特异性二抗避免“撞车”。

实验设计：精准操作

Co-IP 实验不止“拉下”，其他环节也是“硬仗”。

实验环节	说明
实验设计	确定研究的蛋白质对，不胡乱邀请“不相干”的蛋白。
对照组设计	实验组、IgG 阴性组、阳性组 (Input)。
洗涤条件	适当调整洗涤强度 (如低盐到高盐、去垢剂浓度等)，既要去除非特异性蛋白，又要保护靶蛋白复合物。
Western Blot	用 Western Blot来做最后的“身份确认”，确保邀请到的都是真正的“贵宾”。

   

04经典问题和解决方案

如何让你的 Co-IP 实验更上一层楼？

每次实验的具体条件、操作步骤记得详细记录，这样才能在出现问题时找到原因，不断优化喔~

05小结
每一个 Co-IP 实验都是一场精彩的侦探游戏，我们不仅是执行者，更是策略家。这就是科研人的浪漫——在实验中找寻未知的兴奋，用结果揭示生命的奥秘。

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xqliu

学习了，谢谢提供分享。