人源性单抗的制备方法

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当前，人源性单抗已经成为单抗药物的主体（尤其是在研的单抗药物），而人源性单抗的制备主要依赖于两种技术平台，其一为基于转人抗体基因的转基因小鼠+杂交瘤技术，其二为噬菌体呈现抗体库技术。
下面简介不同噬菌体抗体库的构建策略：
1. 天然抗体库（na?ve antibodylibrary）
天然抗体库是指利用正常人外周血中的B细胞作为抗体库基因的来源，制备的抗体库。此类抗体库是最早报道的能够成功应用于单抗制备的抗体库。此类抗体库的典型代表是上世纪九十年代初建立的Cambridge Antibody Technology Group Plc (CAT)。CAT抗体库的构建的基本策略如下：基于合成的全套抗体重链和轻链（包括kappa和Lambda）引物，利用PCR方法从43个健康人的外周血B细胞中扩增出人的轻链和重链可变区基因（Vl和Vh），然后再利用PCR将Vh和Vl构建成单链抗体(scFv)并克隆至噬菌粒，转化大肠杆菌获得抗体库。在1996年，CAT在Nature Biotechnology上报道了其构建的库容超过10E10的天然抗体库。该抗体库成功地用于治疗单抗的制备，其中最成功的单抗就是用于治疗自身免疫性疾病的阿达木单抗（adalimumab ,Humira）,该单抗药物在2013年的全球销售额达到106亿美元。
2.全合成抗体库（fullysynthetic antibody library）
全合成抗体库是指用于构建抗体库的重链和轻链的可变区基因(Vh和Vl)都来源于体外合成，首先合成选定的具有代表性的抗体肧系基因作为模板，然后利用PCR的方法在CDRs区引入设计的突变，从而增加抗体库的多样性。
2.1: Morphosys AG公司的HuCAL（Human Combinatorial Antibody Library）。
HuCAL抗体库是全合成抗体库的典型代表。在2000年，Morphosys报道了其第一代的HuCAL抗体库，HuCAL在构建时选定了7个重链可变区框架（VH1A,VH1B, VH2,VH3,VH4,VH5,VH6）和7个轻链可变区框架（VK1,VK2,VK3,VK4, VL1, VL2, VL3），分别在其CDRs中引入突变后，将重链和轻链进行组合构建了49种不同的单链抗体库(scFv)。库容量达到2*10E9。
其后在2007年，Morphosys 报道了其第二代的合成抗体库（HuCAL GOLD）。HuCAL GOLD的改进包括在引入belta内酰胺酶筛选策略以提高抗体库的正确率，而且将抗体库改为Fab抗体库，并引入其专利的CysDIsplay技术进行呈现，HuCAL GOLD的库容量达到1.6*10E10。
在2011年，Morphosys报道了其第三代HuCAL库：HuCAL PLATINUM。与HuCAL GOLD相比， HuCAL PLATINUM的改进主要是在CDR3中引入长度的变化以增加多样性，并对框架基因进行了重新设计以提高抗体在哺乳动物细胞的表达水平，HuCAL-PANTINUM的总库容达到4.5*10E10,正确率超过70%，这是文献报道的库容最大，正确率最高的抗体库。
利用其三个全合成抗体库，Morphosys一直开展了各种单抗定制服务和治疗单抗的研发。目前在MorphoSys的网站上显示至少有超过20个来自Morphosys抗体库的单抗在开展临床研究（http://www.morphosys.com/pipeline）。
而在2012年12月，MorphoSys宣布将其诊断和研究用抗体研究部门（AbD Serotec）卖给了Bio-RAD，此次交易包括非排他的HuCAL抗体库技术的授权（该授权仅用于诊断和研究抗体的制备）。目前，AbD Secotec作为Bio-RAD的子公司，利用HuCAL抗体库提供单抗的定制服务（http://www.abdserotec.com/），其也是目前唯一一个利用抗体库技术进行单抗定制的服务商，基于该网站信息，基于抗体库技术的单抗定制具有研发周期短（8周），成功率高（>90%）,比杂交瘤技术平台具有明显的优势。
2.2：Genentech
Genentech在2007年报道了其全合成的抗体库。与MorphoSys不同，Genentech在抗体库构建时仅采用了单一重链和轻链框架（humanized 4D5），只是在CDRs中引入突变。Genentech也证明该抗体库可以用于高亲和力抗体的制备。
3.半合成抗体库(Semi-syntheticantibody library)
半合成抗体库是指在构建抗体库时，所使用的抗体基因有一部分是来源于合成的基因片段，而其它部分来源于天然的抗体基因。当前，有多个抗体技术公司报道了其各自的半合成抗体库，其抗体库的设计都各有特点，其中比较典型的两个半合成抗体库如下：
3.1 BioInvent
BioInvent在2000年在Nature Biotechnology上报道了其半合成抗体库。此抗体库的设计是利用固定的轻链和重链模板（分别为VL-DPL3和VH-DP47）,分别在轻链和重链的CDRs区引入天然的CDRs。该抗体库的库容量为2*10E9，现主要用于抗体药物的开发，其公司网站显示，在2014年，有三个来自该抗体库的单抗药物在开展临床或临床前研究（http://www.bioinvent.se/products/pipeline）。
3.2 Dyax
Dyax公司在2010年报道了其半合成抗体库。此Fab抗体库在构建时，轻链部分完全来自于天然抗体（正常人外周血B细胞），而重链可变区部分则进行了半合成的设计，其选择了单一的重链基因框架VH3-23（DP47）,并在HCDR1和HCDR2中引入设计的突变，但在HCDR3区则是引入了天然的抗体基因片段，该抗体库的库容量约为2*10E9，Dyax利用该抗体库进行抗体药物开发。
4.混合库
混合库是指将分别构建的各类抗体库（包括天然抗体库，合成抗体库和半合成抗体库）中的2种或3种不同的类型的子库混合在一起构建而成的抗体库。混合库的优势是即保证抗体库的多样性（天然库及半合成抗体库的特点），又结合了全合成抗体库的人工设计和优化的理念，因而能够有效提高混合抗体库的实用性，理论上可以针对任何类型的抗原筛选到特异性抗体。
北京生物科技有限公司构建了一个高质量大容量的混合库(scFv抗体库)。该混合抗体库包含三类子库，及天然抗体库，全合成抗体库和半合成抗体库。此三类子库的构建策略如下：1）天然抗体库：其天然抗体库的构建策略与著名的CAT类似，从健康人的外周血B细胞扩增人抗体的天然VH和VL基因，然后利用PCR方法构建scFv基因并克隆至优化后的噬菌粒载体。2）全合成抗体库：其全合成抗体库则是选用了在天然抗体库中使用频率最高的几个重链框架和轻链框架，经重组而构建了6个全合成的scFv子库。3）半合成抗体库则是将全合成的3种重链与天然的轻链基因组合或者是将天然的重链基因与两种全合成的轻链进行组合得到，共5种半合成的scFv子库。百特美博的抗体库的库容量超过10E9,正确率超过75%，主要用于为客户提供单抗定制服务，也用于开发新型抗体药物。

左司马

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