原创：细菌内毒素检验方法相关知识

朱小美

本文为蒲公英论坛“巍信群”张云原创，转载请注明出处来源

大家好！我是来自原子高科的张云，今天很高兴跟大家一起分享一下细菌内毒素相关的知识。

今天分享的内容有以下四方面：

1.细菌内毒素的概念

2.细菌内毒素和热原的关系

3.细菌内毒素的来源和控制方法

4.细菌内毒素的检验方法

1.首先谈谈细菌内毒素的概念。

细菌内毒素，英文称作Endotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。.

一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是 革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、 金黄色葡萄球菌以及少数 革兰氏阴性菌。另一类为内毒素（Endotoxin）。是 革兰氏阴性菌的 细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是 脂多糖中的类脂 A成分。

2.细菌内毒素和热原的关系、热原反应

热原（pyrogen）系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。

热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。

    热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。

    细菌内毒素的特性:

                       

去除细菌内毒素的方法

3.1吸附法
此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的 0.1%-0.5% ，将溶液加热到 70 ℃左右保温一定时间效果更好。使用的活性炭应符合药典规定要求。

3.2蒸馏法
此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。

3.3热破坏法
此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用 180 ℃干烤 3 小时，或 250 ℃干烤30min以上。

3.4强酸强碱处理法
此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
其他，也可以采用过滤等方法去除热原。

4.热原及内毒素检验方法

4.1家兔热原法

由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。

《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性 药物制剂。

4.2细菌内毒素检查法（鲎试剂法）

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。

    细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。

1956年 美国人Bang发现美洲鲎血液遇 革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量 革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了 鲎试剂检测法。由于 鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。

鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，鲎试剂法尚不能完全代替家兔法。

在 美国， 鲎试验被称作为“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980年20版美国药典。随后英、德、意、日以及 中国相继在药典中收载了这一检查法。此后 鲎试验逐渐替代家兔 热原试验，但由于部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。2005年版 中国药典规定168个品种进行细菌内毒素检查法，并收录了2种细菌内毒素检查法：包括凝胶法和光度测定法两种方法。前者利用 鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括 浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的 凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法又可分为终点显（比）色法和动态比色法。该方法灵敏度、 精密度高。国内如 厦门鲎试剂厂早在05年即有显色基质（终点显色）鲎试剂盒上市。

凝胶法、比浊法、显色法的原理图：

4.3最常用方法：细菌内毒素凝胶法简介

4.3.1原理：

4.3.2常用英文缩写

BET：细菌内毒素检查  BET水：细菌内毒素检查用水

MVD：供试品最大有效稀释倍数     NC：阴性对照

MVC：供试品最低有效浓度         PC：阳性对照

λ：鲎试剂灵敏度      L：供试品细菌内毒素限值

4.3.3仪器：

4.3.3.1电热恒温鼓风干燥箱

作用：干烤去热原

方式：250℃干烤30min以上。

注意事项：

   从温度达到250℃开始计时。

   干烤过程中不得开启干燥箱的门。

   干烤物品不要叠放不要装载过满，以免影响空气流通。

    设备须进行热穿透、热分布、内毒素挑战等项目的确认。

4.3.3.2漩涡混合器

作用：混旋细菌内毒素

标准品，保证标准品溶液

的浓度一致。

方式：

        对冻干粉的细菌内毒素标准品复溶后，应混旋15min。

        标准品梯度稀释过程中，每步稀释应混旋30s.

漩涡混合后                     漩涡混合前

4.3.3.3试管恒温仪：

作用：提供37℃恒温的环境。

方式：

       对加入了内容物的鲎试剂分别放置于试管恒温仪中，37℃恒温60min±2min温育培养后，观察结果。

4.3.4试剂：

细菌内毒素标准品：工作标准品、国家标准品

鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。

细菌内毒素检查用水：含细菌内毒素的量极低：<0.015EU/ml ，不引入细菌内毒素，对内毒素试验无干扰作用。

4.3.5试验过程：

在进行日常检验前，需要进行鲎试剂灵敏度复核和供试品干扰试验，确定鲎试剂的标示灵敏度的准确性和供试品的最大有效稀释倍数、最小稀释倍数。

灵敏度复核试验：

每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。

试验举例：          内毒素工作标准品为100EU/支；

                  待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。

1）制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下：

2）溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。

3）加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。

反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。

  当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ：

                      λc＝lg-1(∑X/4)

（X:反应终点浓度的对数值。）

当0. 5λ≤λc ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。

样品的干扰试验

注：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂）

当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时。方法为通过比较鲎试剂与在水溶液中的内毒素和供试品溶液中的内毒素反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对内毒素检查有干扰。

操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液，详见下表：

编 号	内毒素浓度/配制内毒素的溶剂	稀释用液	稀释倍数	所含内毒素 的浓度	平行管数
A	无/供试品溶液	－	－	－	2
B	2λ/供试品溶液	供试品溶液	1	2λ	4
			2	1λ	4
			4	0.5λ	4
			8	0.25λ	4
C	2λ/检查用水	检查用水	1	2λ	4
			2	1λ	4
			4	0.5λ	4
			8	0.25λ	4
D	无/检查用水	－	－	－	2
A：供试品溶液     B：供试品阳性对照   C：阳性对照    D：阴性对照

结果判定：

当供试品阴性对照A和阴性对照D都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效。

分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液和稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）；

                     ES =lg-1(ΣXS/4)        Et =lg-1(ΣXt/4)

当ES在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5ES～

    2 ES（包括0.5 ES和2 ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

导致干扰的因素及解决方案：

导致干扰的因素：	排除干扰的方法：
pH值	稀释
抗凝因子	中和
螯合剂	过滤
葡聚糖	加热

4.3.5.3样品的细菌内毒素检验

细菌内毒素限值L的确定

  药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以下公式确定：                                                    L＝K／M

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K= 5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K= 2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K= 0.2EU/(kg·h)；

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、 mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

限值确认时要遵循从严原则，要考虑病人在疾病状态的耐受力和可能存在的联合用药的情况。

2）供试品最大有效稀释倍数的计算：

               C·L

         MVD＝

                λ

λ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。

L：供试品细菌内毒素限值。

C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。

当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml；

当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的单位为mg/ml或者u/ml。

3）供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVD。

含2λ内毒素标准品的供试品溶液（PPC）的制备：

4）加样：取鲎试剂8支，每支加入BET水0.1ml溶解。2支为样品管，加入样品液0.1ml；2支加入阴性对照管，加入BET水0.1ml；2支为阳性对照管，加入2 2λ浓度的内毒素标准品溶液0.1ml；2支为样品阳性管，加入0.1ml含2λ内毒素标准品的样品溶液。

37±1℃水浴中保温60±1min。

结果判断：

      阳性对照为阳性

     阴性对照为阴性              试验结果成立

     样品阳性对照为阳性

    2支样品管均为阴性时，样品符合规定；

    2支样品管均为阳性时，样品不符合规定；

    样品管1支为阳性1支为阴性时，需复试。

复试时做4支样品管，有1支为阳性则样品不符合规定。

结果判断	样品管	阴性对照	阳性对照	样品阳性对照
符合规定	－－	－－	＋＋	＋＋
不符合规定	＋＋	－－	＋＋	＋＋
需复试	＋－	－－	＋＋	＋＋
复试符合规定	－－－－	－－	＋＋	＋＋
复试不符合规定	＋－－－	－－	＋＋	＋＋

4.3.6内毒素检验的注意事项

1)溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，不要剧烈振荡避免产生气泡。

2)由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性结果。

3)在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照应同时进行，并在实验有效的情况下才能进行计算和判断。

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xiao3fei4

学习了，普及知识很不错的资料

lov_new

这个资料有点老了。不过还是感谢楼主的分享。

zlyjy

学习了，谢楼主分享！

尼采

感谢分享   

山中越

感谢分享，这个资料应该更新了。2015年版药典马上就要执行，这个是2010年版的资料。

22311862

学习了，普及知识很不错的资料