浅析微生物发酵原料药的注册---注册圈视频转写，20221201

sdsmliao

浅析微生物发酵原料药的注册（上）---注册圈视频转写，20221201

1、对于半合成的原料药，起始物料的前序路线含一步发酵步骤，制剂为口服途径，原料药需要进行DNA残留和蛋白残留的检测吗？

我觉得可以在起始物料去控，也可以在API当中去控，我觉得基于现在中心的要求来讲，应该还是会要求对蛋白进行控制。蛋白和DNA的残留控制方法，实际上药典当中是有的。但是它可能不会直接写蛋白残留，可以去搜一下，无论是欧洲药典还是中国药典，它在蛋白残留或者叫紫外法的地方都会有很多种控制蛋白残留的方法。包括一些福林酚试剂法，包括一些双缩脲，包括考马斯亮蓝法，还是一些其他衍生的方法，实际上都可以测蛋白残留。包括核酸是在260纳米下测吸光度吧，应该都是可以去控制的，这方面大家可以有目的的去收集一下。

那么限度定到多少，刚才我在讲的时候也提到了，有一些药检所的老师发过一些文章，你的限度肯定不可能高于这些公开的文献发表的东西。另外药典当中有一些控制是有限度的，这些限度推算一下或者是思考一下，也能够计算出来它相应的限度，这些也都可以作为参考的依据。因为蛋白和DNA这种核酸的残留，它不是特别精确的，针对性的一个检测，所以这样一个检测的灵敏度有的时候也不是很高，所以说有的时候要尝试多种不同的方法，找到一种不干扰的方法，对它进行检测，我觉得这样才能达到目的。

对于这种半合成的原料，如果起始物料比如说是7ACA，我觉得你在7ACA当中是不就需要控制，如果你的7ACA控制的真实检出含量比较高，在最终API当中有可能还是需要对它进行检测。当然你做到低于检测限以下，我觉得你的最终的API当中就可以不控。如果最终API的检测限很高，或者是有检出的话，我觉得中心要求你定入成品的质量标准都是有可能的。

2、6APA和7ACA作为起始原料，合成比如舒巴坦钠，他唑巴坦钠等，需要对6APA的研究相比一般化工产品作为起始原料有哪些更具体的研究？

实际上，把6APA作为起始物料的话，刚才我们说的发酵当中的这些产品，有可能都需要在起始物料的内控标准当中对它进行控制。现在我们化药生产工艺信息表当中也有明确，要放入中国药典格式的起始物料的质量标准，在座的应该都是被CDE有提到这样的要求，显然如果中心要求你把这些放到你的6APA或者7ACA里边，它们就一定会被带到化药生产工艺信息表里面，他就会固定下来，我想很多企业是不希望见到的。但是想逃过去，据我所知不太容易，现在中心对这块看得还是很重的。更具体的研究，我觉得你可以把它实际上当做小原料药进行研究，对于半合成的产品来讲，对于6APA和7ACA来讲。

3、如何定义发酵工艺关键中间体？注册资料的过程控制部分，是只需要交关键中间体的标准，还是其他生产过程控制项目的标准也需要交？

这个问题可能没有一个特别统一的答案。发酵工艺关键中间体，我觉得可能从两个方面，一个是半合成原料药里面提到的可分离的中间体，另外生产工艺当中就像之前提到的，你的粗品，第一次拿到可分离的干燥之后的粗品或者是湿品，显然它也是非常关键，甚至有的时候可能需要按照成品的质量标准对粗品进行控制，这样你才能把杂质命运研究给串起来，否则是搞不清楚杂质在什么地方被去掉。

过程控制就是我们说的IPC 3.2.S2.4原则来讲过程控制这部分，要提供全部的中间体和过程控制的相关指标，原则上是需要全部提供的，当然有一些注册策略，就像我刚才说的，分罐终点的案例一样，企业一般是不希望写太多，因为写太多了就给后边的变更带来困难，监管机构是希望写的尽可能详细，可以更好的对你进行监管，所以这是一对相互之间有一些矛盾的点，写到多少是合适的，或者是哪些写哪些不写，我觉得这可能就是注册策略的问题了。

当然这里不是鼓励大家说有意隐瞒什么，但有的时候确实有一些写的过于详细了，确实会给以后获批的生产带来一些不方便，但你写的如果不够详细的话，也就经常会被发补，也是逃不掉的。所以通常在这个地方，原则来讲，应该是提供所有的中间体和过程控制相关的指标。

4、发酵工艺产品的基因毒性杂质研究怎么做？

实际上这个问题是非常开放的，基因毒性杂质怎么做？ICH M7当中有很明确的说法，对于发酵产品，我觉得它跟我们普通化学合成产品的区别，不在乎它的基因毒性杂质的限度有改变，而在乎它的基因毒性杂质的来源是什么。基因毒性杂质很有可能是你加入的底物，或者是你加入的一些成分，它可能会带有这样的警示结构。如果是这种情况，就针对性的去进行检测就好了，其他的跟我们平常的化学药品没有什么区别。同样的道理，如果发酵过程中没有任何可以产生基因毒性杂质的可能，包括连硝酸盐也没有用，有的发酵当中会用硝酸盐和亚硝酸盐提供氮源，如果在这种情况下，可能还要讨论亚硝胺杂质的可能，否则如果你没用，比如说用其他的像尿素这种作为氮源，应该说几乎没有亚硝胺杂质产生的可能。如果用的水还是制药用水的话，这种就只是简单论述一下，我觉得这个问题实际它不是具体的问题，它是开放讨论的问题，你对你的工艺是最了解的，你就看你工艺当中是不是可能引入或者产生基因毒性杂质就好了。

5、发酵原料药工程菌种来源合规性及菌种鉴定应如何做？做到什么程度？比如从非专业机构购买的工程菌种，是否合规？或者如何做能合规？

非专业机构应该指的就是非ATCC，CMCC这样的机构购买的工程菌种是否合规。首先从任何企业或者来源买到菌种，只要是合法来源，我觉得都是合规的。如果是非合法来源，就是另外一回事了。实际上在现实中的菌种应该都来自于科技公司，它是不会把它的菌种的全序列或者是一些核心的机密提供给你的，这个是可以理解的，因为他就靠这个生存。

在这种情况下你该怎么办？这种情况下就会很被动。如果你只有购买证明，没法提供工程菌详细的信息，包括它的质粒信息，包括甚至它的DNA全序列的信息，一旦被中心发补，你就没法回复。所以现在好多企业在做这种品种的时候，有的时候可能会自己为自己研究工程菌，或者是通过更加合规，或者共同开发这样的方式去得到工程菌，这样才能够应对中心这样的要求。

如果像一些食品行业，之前对这方面没有要求，或者是没有准备，直接现在去报原料，遇到这样的情况，就非常的被动，几乎是不可能回复的。因为他的合作客户一定是不会给他提供这部分核心的技术的，几乎是不可能给你提供的，所以这块要在产品开发的早期就预料到这一点，否则等到发补的时候就毫无办法。

浅析微生物发酵原料药的注册（中）

6、半合成原料药的起始物料应如何控制，需要跟API一样控制么？

像6APA,7ACA这样的，实际上就相当于一个小原料药，确实是需要的。包括它的有关物质、杂质、分析方法验证，这些都需要去做的，都逃不掉的。如果你拿过来只做含量或者纯度，就往下去投，这个品种是没法批准的。

7、起始物料只有菌种的话，如何分析起始物料引入的杂质？是要研究所有代谢产物都是什么吗？

微生物发酵的产品，它有几种来源，有的是微生物产生的酶类的成分，有的像玻璃酸钠这样是微生物的夹膜，链球菌的夹膜。有的氨基酸是我们天然的有基因缺陷的氨基酸，它没法完成氨基酸的闭合，卡到一个环节了，氨基酸就会不断的富集。有点像人类苯丙酮尿症的孩子，不能够代谢苯丙氨酸，只能产生苯丙酮酸。所以苯丙酮酸就在这样症状的孩子体内蓄积，并且产生毒性，实际上跟这个道理是差不多的。我们可能有的时候要找先天有基因缺陷的这种细菌，或者通过人为改造，让它的氨基酸的合成卡到了一个环节所得到的产品。所以通过不同的原理，我们就会知道有的发酵的时候，这个产品的很多的情况下，你是不可能理想的只发酵你的产品。比如说像红霉素，发酵的时候一定是红霉素ABC三个组分在一起的，它不可能只得到红霉素A。当然它们的比例是不一样的但相对来说也是非常的固定的，因为微生物有自己的生物合成，它们的组装是非常的精确和精密的。所以对于这种发酵液，如果你的产品有紫外吸收，实际上是可以通过技术手段直接检测反应液，或者对反应液进行初步的处理以后，或者是深加工以后，去做一个类似于像指纹图谱一样的东西，这个东西是可以去尝试的。另外就是这样的一个研究，比如说像玻璃酸钠一样，它就是夹膜的多糖的一个链，它所谓的杂质实际上就是不同的长短大小的玻璃酸钠。体现它分子量的大小和分子量的分布，所以对于这种发酵的产品来讲，我觉得很多情况下它的杂质谱相对来说是比较固定的。

这些杂质的比例，还有产生都不会随便的变的，特别是不会变好。应该正常来讲药典上的杂质，可能都会有，可能有一些会小一点，有一些会大一点。所以我想对于发酵产品的杂质谱，它这种起始物料引入的杂质并不是菌种，当然你也可以讨论，我在菌种摇瓶和斜面的时候，我有对它有质量标准，包括没有杂菌的生长。这方面是属于菌种或者存在过程当中的质量控制，但是它跟我们化学合成当中，起始物料引入在杂质讨论的套路还是存在明显的区别。

8、发酵底物可以作为起始物料吗？

应该是两种情况下比较多，一种是发酵让一些基团的构型发生反转，比如说鹅去氧胆酸，通过两步的生物发酵。一步是羟基氧化成酮，另外酮再被还原成羟基。它就从左旋翻到了右边，从鹅去氧胆酸得到了熊去氧胆酸，这种情况下鹅去氧胆酸可以定义为起始物料的。往里加的菌种和酶，实际上是发生酶促反应。它是催化剂的作用，这种情况下，可以把鹅去氧胆酸定义为起始物料。还有一种情况下，我们做的糖皮质激素类的。比如说我们的可的松，直接发酵来的。当然它是从植物提取的产品经过化学处理之后得到的底物发酵来，后边可能会得到氢化可的松、氟的松、强的松等等一大堆东西。所以可以把这种具有甾烷结构的底物，把它定义为起始物料的。这种情况下，我们往里加入的菌泥、或者是酶或者是微生物，实际上是起到了催化剂的作用，这种情况下就是可以的。但是比如说我们发酵一般的产品，比如像维生素类的产品，就不能把玉米和淀粉跟菌种当成起始物料，这个就不太合适了。

9、菌种稳定性需要递交哪些以及哪种程度的证明资料？

这方面确实没有特别多现成的法规。但是我刚才也说了一些生物制品的法规，其实生物制品在前边，原液的生产跟微生物发酵原料的发酵很接近，所以有一些东西也是可以参考的。

关于菌种的稳定性，一般从广义来讲有两种：一种是传代稳定性，一种是贮藏期间的稳定性。贮藏期间的稳定性，应该在GMP当中有相关的规定，您直接看GMP就可以了。

传代稳定性主要是考虑原始菌种到工作细胞库到主细胞库这样的传代和扩培的情况。中国药典2020年版4部通则1106、1107，关于微生物限度这块也要求了，这样1个菌应该是传代不超过5代的，包括F0代的定义，也在这里边有了。同样的道理，它为什么要做这样的规定？菌种在传代的过程中，它有可能会发生退化或者是变异，这是自然界的规律。所以对于官方来讲，他不希望受这方面的影响因素会更加多。所以我们来讲，为什么要求企业希望建这种三级细胞库，现在很多发酵也是有点参考生物制品的意思了，包括相关的东西都要做起来，也有这方面的原因。传代稳定性也是一样，一般来讲至少得传5代，如果要5代都不稳定的话，坦白的说你没法生产。

所以菌种稳定性其实最主要的还是传代的稳定性的研究，比如说你在传代5代10代或者其他代数之后，前后菌种的生理、生化、显微鉴别、DNA、RNA序列检测、发酵的指纹图谱，包括它的产量都没有发生明显的变化，这是我们要证明的。否则到时候工艺还是不稳定的，官方也肯定会给你发补，主要是关于菌种稳定性。

10、菌种遗传稳定性和生物学稳定性研究，是针对商业菌株的？还是工作菌株的？为什么要补充传代次数要求？

这个道理是一样的，我刚才说了中国药典当中都有规定，传代有规定。因为传代就是变异的积累，它也有可能会发生自己的退化，这个没办法，就是自然界的规律。但是至于你想要做，用什么阶段的种子库去做传代稳定性，实际上正常来讲，在你研究早期的时候，如果你把它纳入比如说原始细胞库主细胞库的界定里面的时候，也可以在那个阶段去做。后面正常来讲，我见到的可能还是做主细胞库的多一些，当然也有其他人去做。其他的菌库的传代稳定性，实际上跟你的工作菌库的定义也是有关的。

传代的次数刚才也说了，一般来讲至少要做到5-10代，这个可能要多一点，5代以内不满足生产要求，很快就可能就用完了，10代以上一般来讲也做不到，一般是做到5-10代要多一些。

浅析微生物发酵原料药的注册（下）

11、发酵类原料药质量控制中的蛋白残留和核酸残留，应该参考哪些指导原则？

没有明显直观的指南，需要大家从多方面去寻找这方面相关的研究和参考、借鉴的意义和依据。

12、发酵类原料药如何在质量控制中体现培养基残留，该参考哪些法规？起始物料包括生产菌种吗？目前各国对转基因类生产菌种是否有要求，如产品中残留界限问题？在“体内代谢物的安全性风险很低”的认知情况下，如何不做毒理实验，阐述基因毒性？

这也没有法规，我们做注册没有那么多法规可参考的，很多时候是要实践的，这才是我们注册人员的价值。所以刚才也说了，要知道你培养基是什么，它是以什么形式残留到产品当中，然后去根据你的知识管理和相关的情况去制定针对性的检测方法。这个是这样的，而不是说法规规定豆饼残留多少，花生残留多少，没有法规。所以你要去针对性的去做一些研究和讨论，而且不是所有的东西都需要去检测的。很多的时候可以通过讨论，可以把这件事情说清楚，但是如果没有讨论的话就会发补。当然如果你知道这个套路，这些东西被发补了也不是什么难事，但如果要不知道，可能会非常的手足无措。

起始物料，包括生产菌种，刚才也说了我们对于传统微生物发酵，起始物料就是描述我们菌种的过程，对转基因类生产菌种是否有要求，产品中残留界限问题？转基因的话，我理解的话就是你说的工程菌，这方面我也不是专家，但是我从工作当中我的感觉。如果你用的是工程菌，评审机构会更加的关注，比你来自于天然的、有明确的菌株这种种属清晰的要更加的严格的控制。

你在菌种的来源，包括表达制法，包括遗传传代，包括控制各个方面，可能要比这种天然的菌株做的研究要更加深入一些才可以。

毒理实验基因毒性，我做的产品还没有涉及过。我刚才提到了一个概念，正好这里面说一下，我们很多菌种，鉴定实际上是要鉴定到株的，有很多只鉴定到了种，连属都没有，说不过去的。

13、如何合理的制定发酵产品的非特定杂质标准？

如果你要是确定是你的发酵产品的话，我觉得两个指南可以参考：一个是药典各论的要求，另外是欧盟EMA的抗生素指南，就参考这两个指南。FDA实际上还是有关于蛋白还有多肽类的指南，也可以参考，这个指南有时候也是有帮助的，有一些发酵产品也会落到这个指南上，那个可以看一下。

14、抗生素活性（效价）测定：药典没有列出申报品种的试验菌及试验条件，是否可以参照同类型产品的试验菌及试验条件，如否，应当如何检测，是否有推荐的指导原则推荐？

坦白的说我自己没有做过效价的额定，现在很多产品效价的测定慢慢的被一些液相、或者色谱方法所代替了。我之前有一个案例是，中国药典是效价，欧洲药典是色谱法，中心发补的时候还是建议我们用色谱法，对它进行控制而不是单纯用效价进行控制。

药典没有列出申报品种的试验菌及试验条件，是否可以参照同类型产品的试验菌及实验条件，如否，应当如何检测，是否有推荐的指导原则？这个我确实是没有做过这方面的研究，对这个也知之甚少，我所了解的是这方面还是经验性很强，就和我们做冻干、发酵的老工人一样，经验性还是很强的，我本人并不知道该怎么做。我只知道中国药典中的一些效价，如果国外药典当中有一些色谱法进行准确定量，中心可能会建议申请人改成直接测出的色谱法来进行含量的测定，这是我的一个建议，但具体的操作我确实不太知道。

15、发酵产品可以不设定中间体吗，杂质谱怎么分析？

发酵产品不设中间体的话我还真报过，中心也没有提出很多东西。因为确实有的时候产品就是在柱子上吸附来吸附去，最后完全纯化了之后直接喷雾干燥，得到API，确实没有可分离的中间体。但是没有可分离的中间体，不代表什么都不做。每一步的中间过程控制还是能够跟踪产品的质量的，不是非得要离心干燥了以后拿到固体粉末在手里才能控制。所以我想这一块还是可以像我刚才说的那个思路，可以不设中间体，如果在你的情况下，但是该做的话还是需要去做。杂质谱怎么分析呢？我刚才也说了，可以取中间过程控制中的反应液，按照成品的方法取进行检测，还是能够监控杂质的产生和去除的。特别是在早期阶段，对于过柱子这些监控的话我觉得正常研发都会做，可能随着你数据的积累，你可能在生产当中不用实时的检测或者实时的控制，这些数据你应该是有的。如果你要没有的话，我只能说要不就是工艺是有基础的，要不就是不想体现那么多东西。实际上一个合理的过程，这些东西都是要有的。

16、多组分的发酵类原料药需要对各个组分都进行立体结构鉴定吗？

这个我实际上坦白地说，我遇到的案子的话还没有遇到过这样，因为进行多组分原料药的话。比如说像红霉素，红霉素ABC，中国药典是有红霉素ABC的对照品的，所以我们结构确认的时候，而且红霉素A应该是占到了98%，我没记错的话。所以它那么大的一个分子量当中的侧链是甲基还是氢，并不会改变结构确认的核磁和质谱的结果。

所以没有对它进行特别的鉴定。当然如果你遇到的产品很特殊的话，有的时候是不是可能需要你综合多种去进行鉴定。比如说官方的法定对照品，比如说你质谱的情况，有可能这方面是需要进行鉴定的。

猫咪特工

谢谢分享

君临沧海

谢谢谢谢谢

圣剑之心

谢谢分享，总结的很不错

xqliu

学习了，谢谢提供分享。

Vicky范范

学习了，谢谢提供分享。

xwf19770216

谢谢分享，总结的很不错

余默

太好了

吉首黔哥

谢谢分享

luobitao

谢谢分享，总结的很不错

funstone

感谢分享，真的很不错！