小奕说药 | 氧化还原电势传感器在CHO细胞培养中的应用

奕安济世生物药

一、PAT 简介

随着生物制药行业的发展，过程分析技术PAT（Process Analysis Technology）越来越引起人们的关注。2004年FDA发布的过程分析技术指导性文件中明确规定了PAT的定义：“一个通过即时测量原料、过程中物料和过程本身的关键质量指标来实现设计、分析和生产控制的系统，目的是确保最终产品的质量”[1]。PAT是未来改变生物制药行业的重要技术之一，而实时监测分析是实施该技术的关键。在规模化细胞培养过程中，实时在线监控主要包括对DO、pH、pCO2、过程代谢[2]、细胞生长、氧化还原电势（ORP，Oxidation-Reduction Potential）等参数的在线监测及基于拉曼光谱原理的实时产品质量分析[3]等技术。实时在线监控技术相较于传统离线分析技术有更高的效率，对后续工艺参数调整具有重要意义，是确保产品质量稳定的重要手段之一。

二、氧化还原电势传感器在CHO细胞培养中的应用

氧化还原电势传感器在抗体类生物制品生产中具有多种应用，其中利用其监控细胞培养过程中的氧化还原电势变化从而避免抗体分子的二硫键发生非预期还原是重要的应用之一。在抗体药物大规模生产过程中，抗体链间二硫键还原现象是生物技术行业关注的焦点之一，它可能导致产品损失、增加纯化过程的复杂性以及降低药品的稳定性，甚至直接导致生产批次的失败。据文献报道，抗体链间二硫键的还原很大程度上和生产过程中的氧化还原电势(ORP)有关。文献里指出在细胞培养过程中，存在ORP阈值（-70MV），低于该阈值抗体链间二硫键被还原的风险较高，而ORP值高于该阈值抗体链间二硫键被还原的风险则较低[4] 。在本文中，介绍了在上游细胞培养过程中利用氧化还原电势传感器实时监控细胞培养过程中氧化还原电势变化，并通过添加铜离子提高培养液中的ORP值，避免抗体链间二硫键被还原的实例。

本案例中使用CHO K1细胞表达单克隆抗体，采用加强型流加培养模式，培养时间为11天。对产品进行nrCE-SDS分析后，发现产品中部分二硫键被还原。为调查二硫键被还原的原因，我们设计了研究实验：一组为对照组，另一组在培养过程中添加铜离子来控制其ORP值。两组实验都利用氧化还原电势传感器对细胞培养液中的ORP值进行在线实时监控。实验结果显示添加铜离子并未对细胞生长、细胞活率与抗体的表达量（图A、图B）产生影响。但同时，在培养过程中发现，对照组的ORP值长期低于-50MV，明显低于添加铜离子的组别（图C），对样品进行nrCE-SDS分析后发现对照组主峰前峰（pre-Peaks）比例明显高于添加铜离子组别（图C），说明对照组二硫键被还原的比例明显高于添加铜离子组别。上述结果表明，通过氧化还原电势传感器实时监控环境中的氧化还原电势，我们可以准确地评估二硫键被还原的风险大小，并且可以提前采取措施如添加铜离子等提高环境中的ORP值，从而预防在上游生产过程中抗体的二硫键发生非预期还原。

图A：活细胞密度（实线）与细胞活率（虚线）

图B：抗体表达量

图C：氧化还原电势ORP（实线）与nrCE-SDS主峰前峰比例（虚线）。结果提示，添加铜离子并没有影响细胞生长、细胞活率与抗体表达量（A、B图）。添加铜离子可以显著提高培养环境中的ORP值，从而降低抗体链间二硫键被还原的风险（C图）。

三、小结

氧化还原电势传感器在抗体大规模生产过程中具有多种应用。对于二硫键在细胞培养过程中的非预期还原，我们可以使用氧化还原电势传感器监测环境中的氧化还原电势并通过添加金属离子等方法来避免该情况的发生。

四、参考文献

[1] FDA: Guidance forIndustry PAT-A Framework for Innovative Pharmaceutical Development Manufacturing and Quality Assurance [EB/OL], 2004, September.

[2] An Zhang, Valerie Liu Tsang, Brandon Moore, Vivian Shen, Yao-Ming Huang, Rashmi Kshisagar, Thomas Ryll: Advanced Process Monitoring and Feedback Control to Enhance Cell Culture Process Production and Robustness, Biotechnol Bioeng. 2015;112: 2495–2504

[3]  Zimin Liu, Zhijun Zhang, Yongjun Qia, Gong Chena, Jun Hu a, Qing Wang, Wei chang Zhou, The application of Raman spectroscopy for monitoring product quality attributes in perfusion cell culture, Biochemical Engineering Journal.2021, 173:108064

[4]  Michael W. Handlogten, Jihong Wang, Sanjeev Ahuja: Online control of cell culture redox potential prevents antibody interchain disulfide bond reduction, Biotechnology and Bioengineering. 2020; 117:1329–1336.

xqliu

学习了，谢谢提供分享。