ELISA实验注意事项以及常见问题解答

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ELISA实验注意事项以及常见问题解答

酶联免疫吸附测定(ELISA)被称为免疫测定金标准。是一种免疫学测定方法。ELISA是用于测定抗原抗体，根据样本不同的类型和检测方法来进行相应的制定。主要类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、双抗原夹心法。

双抗体夹心法是常用的ELISA检测类型，它是利用一个抗体进行捕获，另外一个抗体进行检测。双抗体夹心法具有高特异性和高灵敏度，非常适用于复杂样本，但夹心法通常检测时间较长，难度大于其他方法。

一、双抗夹心法实验步骤：

二、双抗夹心法实验操作注意事项：

1、样品稀释：

（1）稀释血清避免假阳性的发生（把蛋白按照一定的倍数稀释，如10倍、20倍，将抗原进行稀释包被反应；用稀释好的阳性参阅血清和阴性参阅血清进行孵育后洗刷，加入酶结合物进行反应，孵育洗涤，加入底物显色，停止反应后分别测定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀释度为适合的包被浓度。阴性参阅血清O.D值<0.1-0.2。这样阳性参阅血清和阴性参阅血清的O.D值就会有明显差别）。

（2）粉末型样本需要短暂离心，如沾到管盖、管壁需要将标准品沉入管底；加入蒸馏水时需短暂轻柔涡旋，静置10-30min，充分溶解。

（3）加水后等待充分溶解后可选择吸吹或涡旋混匀。

2、试剂平衡：

（1）所有的试剂和样本需平衡至室温5-10min，避免产生动力学反应差异这会影响准确性。

3、混匀：

（1）稀释前、后的样品需进行摇床充分混匀。

4、加样操作：

（1）定期校准移液抢。

（2）加样前需混匀，避免加入到孔壁上，尽可能避免气泡产生。

（3）避免样本溅出（可用吸水纸吸取溅出液体）。

（4）避免加样反复吸取导致样本污染。

（5）加样操作按照说明书的顺序来进行，确保显色时间一致。

5、孵育：

（1）震荡孵育，加快抗原抗体之间的相互接触，使反应更加充分。

（2）水浴温度保持37℃。

（3）水浴需要封闭防止污染。

6、洗板：

（1）洗液尽量不要溢出孔外。

（2）拍过酶标记物后及时更换吸水纸，避免影响实验的准确性。

（3）手工洗板时拍板要垂直且用力不能过猛，可避免交叉污染。

（4）扣干后的酶标板应快速加液，避免干板太久。

（5）采用全自动时需检查各项水瓶是否充足。

（6）采用全自动时检查是否堵塞。

7、显色：

（1）显色需控制好时间（根据说明书操作）,时间过短,结果偏低；时间过长,空白增高/非特异性显色增加。

（2）显色呈梯度。

8、比色：

（1）跟换滤光片时注意错用的可能性。

9、检测：

（1）酶标仪使用前预热10-15min，结果更稳定。

（2）双波长测定吸光值，可以减少指纹、杂质等带来的误差（检测波长450nm-参考波长630nm(570nm)）。

二、试剂盒选择注意事项：

1、选择明确：

（1）样本种属类型

（2）样本类型：

2、样品中检测物水平选择：

（1）宽动力学检测范围：对样品种待测物水平没有任何参考数据。

（2）高灵敏度试剂：待检物含量很低。

3、样品获得性选择：

（1）通常试剂盒的样品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。

4、试剂盒技术参数选择：

（1）回收率达到80-120%之间。

（2）按照国际标准示值误差：100μg。

（3）误差系数＜5%-8%。

（4）建议优先考虑双单抗。

（5）操作方便

三、常见问题解答：

1、样本的处理、收集和保存问题：

（1）细胞培养上清通过离心收集，分装保存，温度-20℃。

（2）血清样本分离管分离血清，样本凝集30min后离心，吸取血清立即检测，分装保存，温度-20℃。

（3）血浆样本采用EDTA收集样本，需在30min内离心，吸取样本立即检测，分装保存，温度-20℃。

（4）避免选择严重溶血或高血脂样本，收集后快速检测并储存，若未能在24h内检测，可暂时存放2-8℃。

（5）分析前样本需缓慢恢复至室温，注意是否有沉淀物需祛除干净。

2、样本反复冻融，具有哪些影响：

（1）蛋白易降解。

（2）细胞上清冻融1-2次后，蛋白降解严重。

3、阴性对照和空白对照的区别：

（1）空白对照：稀释液代替样本，检测显色本地，读取阳性、阴性、样本孔的吸光值。

（2）阴性对照：样本与待检测物具有同源、同质性，但不含有待检测物质，可鉴别处理因素之间的差异性。

4、添加显色后，无色或阳性对照弱：

（1）试剂盒需采用同批次。

（2）注意稀释倍数是否正确。

（3）酶结合物是否未添加。

（4）试剂是否添加错误。

（5）显色液是否变质。

（6）确认各项容器干净无污染。

（7）注意配置时看清标签和说明书。

（8）观察液面高度是否一致，避免试剂漏加。

5、样本浓度不正确：

（1）标曲是否适合，有无失效等。

（2）样本含量或灵敏度较低无法被检测到，浓缩样本。

（3）样本含量或灵敏度较高，超过标曲浓度需稀释样本。

6、为什么吸光值过高：

（1）若如检测值正确，则显色过高。

（2）波长选择错误，可选择双波长检测。

7、为什么吸光值低：

（1）样本未充分溶解，（混匀后需静置30min)。

（2）样本反复冻融，活性减弱。

（3）孵育的温度和时间为满足要求（按照说明书操作）。

8、无梯度：

（1）样本污染，需要跟换样本。

（2）稀释倍数错误，重新做。

（3）抗体浓度高，更换抗体或稀释。

（4）底物孵育是否时间和温度过短。

（5）孵育需封盖。

实验结果汇总事项：

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学习了，谢谢提供分享。