【耀文解读】一文读懂mRNA纯化方法

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]mRNA药物是近年来新兴的一种形式，其基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内，在体内表达出蛋白抗原并刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护，有制备迅速、成本低诸多优势。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]通过体外转录反应（IVT）合成的mRNA，其反应混合物不仅含有所需的mRNA产物，还含有包括酶（RNA聚合酶、磷酸酶）和模板DNA，以及IVT期间形成的mRNA副产物（主要包括dsRNA和截断的RNA片段）等一些杂质。确保产量的同时，高纯度的mRNA也是保证样品质量和免疫原性的关键。今天，小编带大家一起梳理mRNA样品常用的纯化方法。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1 mRNA反应体系中的杂质

一、氯化锂法（LiCl）1.1 原理介绍

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]LiCl纯化mRNA的原理为锂在一定pH下，能降低分子间的同电相斥，实现RNA的高效沉淀，然后用离心将沉淀分离出来，接着溶解沉淀从而得到纯净的 RNA 样品。LiCl沉淀 RNA原理简单、快速，对不同大小的mRNA的沉淀效果均良好，且得到的产品纯度高。但值得注意的是，氯化锂无法有效沉淀一些小RNA (如tRNA)，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。同时，为确保纯化效果比较推荐使用LiCl沉淀含有至少400 μg/ml RNA的溶液[1]。

1.2 操作步骤LiCl关键纯化步骤如下：1)取IVT产物加入 LiCl溶液，使得 mRNA溶液中LiCl最终浓度达到2.5M；2)将反应在-20°C下冷却30min；3)在微量离心机中以最高速度离心 15min;4)弃去上清液，用冰冷的70%EtOH洗涤沉淀以除去残留的盐，除去乙醇；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]5)将mRNA沉淀重悬于RNase-free溶剂中，注意不要让沉淀完全干燥，否则如果会变得难以重悬[2]。

二、磁珠法2.1原理介绍

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]磁珠是一种可以在磁场作用下定向移动的微小粒子，这些粒子通常由微小的氧化铁颗粒内核与外部包裹的其它物质组成。当有磁场作用的磁性粒子上时，磁性粒子能够沿着磁场方向进行运动，当撤去磁场后，这些磁性粒子也不会有磁性记忆，很容易彼此分离。磁珠纯化是一种常用的分子生物学技术，用于从混合物中快速、高效地富集纯化mRNA分子。不同功能磁珠，其表面修饰官能团不同，常见官能团有羟基、羧基、Oligo（dT）及链霉亲和素等，以用于不同的类型生物分子的分离纯化。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]含羧基官能团的磁珠可以高效纯化核酸，mRNA分子在酸性条件下带有负电荷，可以与羧基磁珠表面的羧基官能团发生静电作用，从而实现选择性富集。通过调节条件，可以控制mRNA与磁珠的结合和解离，从而实现RNA的纯化。mRNA越长，表面裸露出来带负电的磷酸基团越多，整条分子带的负电就更强，更容易吸附到磁珠。反之，如果想回收较短的mRNA片段时，需要加入的磁珠体积更大。另一种用于mRNA纯化的磁珠为偶联Oligo (dT)的磁珠。其基本原理与亲和层析一致，利用磁珠表面的偶联的亲和配体Oligo (dT)与带Poly(A)尾的mRNA分子之间的特异性结合，通过磁力作用将目标RNA分子与其它非特异性结合的杂质分离开来[3-6]。

2.2操作步骤

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]磁珠法纯化mRNA关键步骤如示意图2所示，分为：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]1)将样品与磁珠结合；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2)将磁珠与污染物分离；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3)用乙醇-水溶液洗涤磁珠以去除污染物；

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]4)从磁珠中洗脱mRNA；

5)收集、转移纯化后的mRNA样品。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]利用磁珠法可以从各种体外反应体系中纯化得到mRNA，也适用于低浓度mRNA的浓缩，此法比LiCl沉淀更为便捷、省时，回收率通常可以达到80~90%。使用磁珠法进行纯化mRNA时，需要注意的事项有：（1）磁珠避免冷冻、避免高速离心；（2）磁珠使用前须待其温度平衡至室温后再使用；（3）洗涤磁珠用的乙醇-水溶液推荐现用现配，否则可能会影响回收效率；(4) 请勿长时间干燥磁珠，干燥过度将导致磁珠的不可逆聚集，从而降低洗脱效率。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2 磁珠法纯化mRNA示意图

三、层析法3.1 原理介绍

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]上述两种纯化方法可以制备得到的高mRNA纯度，但纯化量小，仅适合于研究级实验室中使用。对于 mRNA 大规模制备，目前业内主流方法还是层析工艺。基于 mRNA 分子本身的化学特异性，可选的层析方法也很多，包括反相、离子交换、疏水和亲和层析等，但每种方法都有其优缺点。在具体的层析方法选择上，需要综合考虑到可放大性、平台化、纯化效率、回收率、经济性等因素。亲和、离子交换和疏水应用中放大性较好，也是目前应用比较多的纯化方式，尤其是亲和层析目前广泛用于Poly(A) mRNA 捕获，可作为平台化解决方案，有>90%回收率。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]mRNA最显著的结构特征是具有5’cap和3’ Poly(A)尾。这种结构为真核生物mRNA的纯化提供了极为方便的选择标志。亲和层析法与磁珠纯化原理类似，基质表面通过 linker 键合dT 配基，通过 AT 碱基互补配对捕获带 poly（A） 尾 mRNA。在高盐条件下上样，盐离子可以屏蔽填料带负电荷的骨架与带负电的 mRNA 的静电排斥作用，使二者能够相互接近，包含 poly（A） 尾的 mRNA 通过 A-T 氢键连接被捕获。降低盐浓度时，填料负电荷骨架与 poly（A） 产生静电排斥，通过温和中性 pH 与低电导率完成mRNA的洗脱。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3 亲和层析原理图

3.2 工艺参数优化

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]亲和层析法纯化RNA的工艺步骤简单可概括为“高盐结合，低盐洗脱”8个字。但缓冲液、分子大小、温度、样品浓度等均可对其工艺带来极大的影响。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]亲和填料和 mRNA 分子的结合发生在高盐条件下，理论上所有促使 RNA 沉淀的盐都可以促进 RNA 分子和填料结合，但不同类型和浓度的盐会导致填料在选择性上的差异。在纯化过程中，优先选择中性盐，如氯化钠、氯化钾等；盐浓度不足会导致结合载量降低，但在过高盐浓度的环境下，RNA 分子构象会变得更加松弛，RNA 分子之间会更加靠近彼此，导致氢键的混乱结合，因此，要实现高效纯化必须通过实验来筛选最佳的盐类型和盐浓度[7]。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]同时，如图4所示不同分子大小对于工艺收率来说也不一样，分子越大可能伴随其回收率越低，但载量却反而越大。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图4 不同分子大小对工艺的影响

四、总结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在纯化阶段，上述3种方法都有一定缺陷，单一纯化方式均难以去除一些罕见的mRNA产物。总的来说，沉淀法和磁珠法工艺简单且适合科研级别的纯化和产品浓缩，且得到的mRNA产品纯度近乎等同于层析工艺。但上述两种工艺的可放大性较差、且放大成本高昂，如沉淀法对设备要求高(防爆)且需要匹配低温高速离心机，操作繁琐、需要多次沉淀和洗涤，且LiCl溶液对RNA有一定的损伤；磁珠法则需要特殊的磁珠和磁架，且磁珠的悬浮性和稳定性会影响纯化效果。亲和层析虽然可以进行工艺放大，但Oligo (dT)与Poly(A)尾的杂交亲和有局限性，它无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA，而dsRNA会引发人体固有的免疫反应，降低疫苗的效力。对于mRNA分子的纯化，亲和层析工艺与阴离子层析、疏水层析、体积排阻层析以及反向离子对层析工艺的优劣并未有定论，因此需要根据分子特性来进行选择合适的层析工艺。同时，伴随着日益成熟的整体柱层析工艺和二步精纯工艺，都将mRNA的纯化推向了更高水平。

参考文献

[1]LiCl Precipitation for RNA Purification, Retrieved Jan 8, 2024, from https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/references/ambion-techsupport/rna-isolation/general-articles/the-use-of-licl-precipitation-for-rna-purification.html.[2] Product Information Sheet of Lithium Chloride Precipitation Solution, Retrieved Jan 8, 2024, from https://www.thermofisher.cn/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFSAssets%2FLSG%2Fmanuals%2F4386633_LithiumChloridePrecipSol_PI.pdf.[3] Product of BeyoMag™ RNA Clean Magnetic Beads, Retrieved Jan 8, 2024, from https://www.beyotime.com/product/R0081-1ml.htm.[4]Product of VAHTS RNA Clean Beads, Retrieved Jan 8, 2024, from https://www.vazyme.com/product/215.html.[5]Dynabeads™-Based Solid-Phase In Vitro Transcription and RNA Purification, RetrievedJan8,2024,from https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/65020D.[6]RNA Clean XP Performance and Data, Retrieved Jan 8, 2024, from https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/rna-and-cdna/performance.

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][7]News from ThermoFisher Scientific, Retrieved Jan 8, 2024, from https://bydrug.pharmcube.com/new ... e2d978f7dd9228df58.

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