做微生物限度检查方法验证时，供试品溶液配制及供试品阳性对照组加菌量怎么来的？

Yhuan12

       最近我们客户提出，我们做样品的加菌量的浓度出现问题。在这个基础上跟大家讨论一下，做微生物限度检查方法验证时，供试品的配制方法及供试品阳性对照的加菌液浓度（具体数量）。
先说一下这个产品的标准：需氧菌不超过100cfu/g,霉菌和酵母菌不超过10cfu/g。
                                                                     第一次设计：

分别取3份样品各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，溶解，摇匀，为1:10供试液。 供试液稀释：取1支1ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1ml，加入装有9ml灭菌pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1：100供试液。取1支1ml灭菌吸管吸1：100均匀供试液1ml。每递增1稀释级，必须另换一支吸管。 l 供试品溶液组： 吸取1：10、1：100二级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释吸收液时可用1支吸管），每一稀释级注2个平皿中，再分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后在30~35℃培养箱中倒置培养，作需氧菌总数培养；另吸取1：10、1：100二级稀释液各1ml同上操作作霉菌和酵母菌总数培养。注入2个无菌平皿中，分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后在20~25℃培养箱中倒置培养。

l 试验组： 需氧菌总数：分别取1:10供试液、1:100供试液10ml，再分别加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上5种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种试验菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。 霉菌和酵母菌总数：分别取1:10供试液、1:100供试液10ml，再分别加入0.1ml白色念珠菌和黑曲霉菌悬液（每毫升不大于10000cfu），混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。

l 菌液对照组：分别于10ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入0.1ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上五种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。分别取白色念珠菌、黑曲霉对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。按试验组的计数方法测定其菌数。 l 阴性对照组：分别移取1ml稀释液（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）至4个平板培养皿，按试验组的计数方法，其中2个平皿倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，2个平皿倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定阴性对照组。

l 培养条件：胰酪大豆胨琼脂培养基上的培养物于30~35℃培养不超过3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基上的培养物于20~25℃培养不超过5天。

可接受标准：

l 试验组菌落数减去供试品溶液组菌落数的值与菌液对照组菌落数减去阴性对照组菌落数的值的比值应在0.5~2范围内。 第二次设计： 取样品50g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解并稀释至100ml，摇匀，为5:10供试液。 l 供试品溶液组： 吸取5:10供试液各1ml至每个灭菌平皿中，注2个平皿中，再分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，待凝固后在30~35℃培养箱中倒置培养，作需氧菌总数培养；另吸取5:10供试液各1ml同上操作作霉菌和酵母菌总数培养。注入2个无菌平皿中，分别倾注15~20ml不超过45℃熔化的沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，待凝固后在20~25℃培养箱中倒置培养。 l 试验组： 需氧菌总数：分别取5:10供试液10ml，再分别加入0.05ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上5种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种试验菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。 霉菌和酵母菌总数：分别取5:10供试液10ml，再分别加入0.05ml白色念珠菌和黑曲霉菌悬液（每毫升不大于1000cfu），混匀。分别取上述试验菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。 l 菌液对照组： 分别于10ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入0.05ml金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉以上五种菌悬液（每毫升不大于10000cfu），充分混匀。分别取上述对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。分别于10ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入0.05ml白色念珠菌、黑曲霉以上两种菌悬液（每毫升不大于1000cfu），充分混匀。分别取白色念珠菌、黑曲霉对照菌液1ml至平板培养皿，倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基（每种菌液制备2个平皿），混匀，待凝固后进行培养。按试验组的计数方法测定其菌数。 l 阴性对照组： 分别移取1ml稀释液（pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）至4个平板培养皿，按试验组的计数方法，其中2个平皿倾注20ml左右不高于45℃胰酪大豆胨琼脂培养基，2个平皿倾注20ml左右不高于45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基，测定阴性对照组。 l 培养条件：胰酪大豆胨琼脂培养基上的培养物于30~35℃培养不超过3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基上的培养物于20~25℃培养不超过5天。 可接受标准： l 试验组菌落数减去供试品溶液组菌落数的值与菌液对照组菌落数减去阴性对照组菌落数的值的比值应在0.5~2范围内。

Yhuan12

想问一下供试品阳性对照组的加菌量是否与产品的限度有关系？

Yhuan12

请问，第一次的验证符合中国药典、欧洲药典和美国药典吗？

过渡々

1.在国内就根据中国药典规定执行“取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。”  所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
2.要看欧洲药典和美国药典相关规定是否一致      计数方法适用性考察的是产品的抑菌效果，因从1:10的供试液实验至1:1000或添加中和剂、灭活剂    哪个稀释级别及供试液制备方法回收率合格，报告中就填写哪种；但在日常检验中通常1:10  1:100  1:1000  都需要进行检验

Yhuan12

过渡々 发表于 2024-7-13 14:18
1.在国内就根据中国药典规定执行“取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所 ...

感谢老师。

sunkiller

过渡々 发表于 2024-7-13 14:18
1.在国内就根据中国药典规定执行“取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所 ...

专业回复！！！

大周

Yhuan12 发表于 2024-7-12 17:46
想问一下供试品阳性对照组的加菌量是否与产品的限度有关系？

按药典要求，没规定加菌量与限度有关系啊